Verifizierung mit einer 100%igen DMSO-Probenlösung

Leistungsfähigkeit von Liquid-Handling-Systemen

Dimethylsulfoxid (DMSO) ist aufgrund seiner guten Lösungsfähigkeit für eine Vielzahl von Substanzen inzwischen eines der wichtigsten Lösungsmittel für Anwendungen in den Bereichen Hochdurchsatz-Screening (HTS) und Substanzverwaltung (Compound Management).

Außerdem ist es das Lösungsmittel der Wahl für eine neue Generation von Liquid-Handling-Geräten mit akustischem Tröpfchenausstoß (ADE – Accoustic Droplet Ejection). Dazu zählen beispielsweise von Firmen wie Labcyte (Sunnyvale, CA) oder EDC Biosystems (Freemont, CA) entwickelte Modelle, die das HTS und die Substanzverwaltung revolutioniert haben.

Bild 3: Leistung des MVS bei Volumina von 100…999 nl in MVS-Verifizierungsplatten mit 96 Kavitäten.

Die für Kalibrationen und Leistungsprüfungen am häufigsten verwendete Flüssigkeit ist Wasser. Da sich die physikalischen Eigenschaften von DMSO jedoch stark von denen des Wassers unterscheiden, verhält sich DMSO in Pipettoren, die nach dem Prinzip der Luftverdrängung arbeiten, und in akustischen Transfersystemen anders und erfordert daher eine reagenzspezifische Volumenverifizierungsmethode.

Artel hat nun eine 100%ig DMSO-basierte Farbstofflösung zur Verwendung mit dem Artel MVS® Multichannel Verification System entwickelt und charakterisiert. In diesem Artikel werden die Anforderungen an eine DMSO-basierte Lösung mit zwei Farbstoffen für das MVS sowie ihre Leistungsmerkmale erörtert. Mit der neuen DMSO-basierten Lösung ist selbst die Messung von dispensierten Volumina von nur 10 nl möglich. Ferner wird die Leistung dieses neuen Farbstoffs mit der herkömmlichen gravimetrischen Messung verglichen.

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Einführung
Nahezu alle in Mikroplatten durchgeführten Assays sind von der Konzentration und somit vom Volumen abhängig. Daher ist es von entscheidender Wichtigkeit, dass die bei der Vorbereitung von Assayplatten überführten Volumina exakt bemessen sind [1].

Untersuchungen von Dr. Nathaniel Hentz von der North Carolina State University (Raleigh) haben belegt, dass die bei Wirkstoff-Screening-Programmen dispensierten Volumina einen signifikanten Einfluss auf die Ergebnisse der Assay-Analyse haben können [2]. Jeder Fehler während des Dispensierungsvorgangs verändert die Konzentration des Wirkstoffkandidaten und verfälscht möglicherweise die Daten zur erzeugten Aktivität der Substanzen. Neueste Forschungsdaten deuten darauf hin, dass bei zwei auf- einander folgenden ungenauen Flüssigkeitsüberführungen die sensiblen Reagenzkonzentrationen um bis zu 50 % verändert werden können [3].

In der Vergangenheit wurde die Leistung bei der Dispensierung von Flüssigkeiten entweder mit Wasser oder mit Testlösungen auf Wasserbasis gemessen. Diese Methode ermöglicht einen guten Einblick in die Funktion automatisierter Liquid-Handling-Systeme (ALH) mit Wasser als Testreagenz. Die auf zwei Farbstoffen basierende Ratiometric Photometry™-Methode des Artel MVS® wurde zunächst entwickelt, um die Leistung von Liquid-Handling-Geräten bei der Dispensierung von MVS-Farbstoffen auf Wasserbasis zu testen, die Wasser imitieren sollten.

Bei dieser Methode nach dem Absorptionsprinzip kommen zwei verschiedene Lösungen zum Einsatz:

1. MVS-Probenlösung, die roten Farbstoff in einer bekannten Konzentration enthält (in einigen Probenlösungen ist zusätzlich blauer Farbstoff in bekannter, konstanter Konzentration enthalten).

2. MVS-Verdünnungslösung, die blauen Farbstoff in einer bekannten, konstanten Konzentration enthält. Der in der Proben- und Verdünnungslösung verwendete rote und blaue Farbstoff haben jeweils unterschiedliche Absorptionspeaks bei zwei verschiedenen Wellenlängen, nämlich 520 nm (roter Farbstoff) und 730 nm (blauer Farbstoff).

Bei Verwendung des MVS wird das benötigte Volumen der roten Probenlösung in Mikroplatten mit 96 oder 384 Kavitäten dispensiert. Danach wird Verdünnungslösung zugegeben, um das Gesamtarbeitsvolumen auf entweder 200 µl (bei Platten mit 96 Kavitäten) oder 55 µl (bei Platten mit 384 Kavitäten) zu erhöhen. Anschließend werden für den roten und den blauen Farbstoff fotometrische Messungen bei den jeweiligen Wellenlängen durchgeführt und die Ergebnisse erfasst. Das System berechnet gleichzeitig Richtigkeit und Präzision, ohne dass die Notwendigkeit besteht, Standardkurven oder -lösungen vorzubereiten. Die Messergebnisse sind auf internationale Standards rückführbar, was eine methoden-, geräte- und standortübergreifende Standardisierung der Methoden ermöglicht.

Es ist jedoch allgemein bekannt, dass diese Methode die Leistung automatisierter Liquid-Handling-Systeme im Falle der Dispensierung organischer Lösungsmittel nicht akkurat wiedergibt. Während anhand eines Tests mit wässriger Lösung genaue Vorhersagen über Änderungen der Geräteleistung gemacht werden können, muss die Pipettierleistung dagegen mit dem tatsächlich verwendeten Reagenz gemessen werden, um die Variabilität des Assays zu minimieren.

Zunächst wurde eine Applikation für das MVS entwickelt, die in geringem Rahmen DMSO-Tests auch mit einem Volumen von nur 100 nl in einer Mikroplatte mit 384 Kavitäten ermöglichte. Für diese Applikation mussten die Benutzer aus DMSO und wässriger MVS Stock 1-Probenlösung selbst eine ca. 75…80%ige DMSO-Testlösung herstellen. Mit dieser Funktion konnte zwar eine Volumenverifizierung mit einer DMSO-haltigen Lösung vorgenommen werden, sie bot jedoch nicht die Möglichkeit zur Prüfung der Pipettierleistung mit einer 100%igen DMSO-Lösung [4]).

Nun wurde eine 100%ige DMSO-Probenlösung zur Verwendung auf dem MVS entwickelt. Diese neue DMSO-Range-E-Probenlösung ist zur Messung von Volumina bis zu einem Minimum von 10 nl ausgelegt. Wie bei allen MVS-Probenlösungen sind die Ergebnisse auf internationale Standards rückführbar.

Auswertung der Leistungsfähigkeit der 100%igen DMSO-Range-E-Probenlösung
Bei der Entwicklung der DMSO-Range-E-Probenlösung wurde darauf geachtet, dass sie mit allen vorhandenen MVS-Produkten kompatibel ist, einschließlich der MVS-Verdünnungslösung und der MVS-Verifizierungsplatten, deren Kavitäten von Artel eingehend charakterisiert werden. Die Integration dieser neuen DMSO-Lösung in das MVS sorgt bei der Verwendung diverser Liquid-Handling-Systeme für einfache Vergleichs- und Standardisierungsoptionen, unabhängig von ihrem Standort und davon, ob sie wässrige Lösungen oder Lösungen auf DMSO-Basis dispensieren.

Um die Leistungsfähigkeit der 100%igen DMSO-Farbstofflösung nachzuweisen, wurde ein Vergleich zwischen einem gravimetrisch ermittelten und einem mit dem MVS gemessenen Volumen angestellt. Für dieses Experiment wurden vordefinierte Volumina der DMSO-Range-E-Probenlösung mit wässriger MVS-Verdünnungslösung verdünnt. So wurden repräsentative gravimetrische Verdünnungen vorbereitet. Dieses Verfahren fand ebenfalls für die Range-E-Probenlösung auf Wasserbasis Anwendung, um einen Vergleich zwischen den beiden Lösungen (DMSO-Range-E-Probenlösung vs. wässrige Range-E-Probenlösung) zu ermöglichen.

Mit einem kalibrierten automatisierten Liquid-Handling-System wurden jeweils 200 µl jedes Verdünnungspräparats in alle Kavitäten einer Verifizierungsplatte mit 96 Kavitäten bzw. 55 µl in alle Kavitäten einer Verifizierungsplatte mit 384 Kavitäten gegeben. Das gesamte in jede Platte dispensierte Lösungsvolumen wurde anhand gravimetrischer Messungen ermittelt, und das Ergebnis wurde zur Berechnung des durchschnittlichen Dispensierungsvolumens pro Kavität verwendet. Die in jede Kavität dispensierten Volumina wurden anschließend mit dem MVS bestimmt. Die bei den gravimetrischen Messungen ermittelten Werte wurden dann mit den vom MVS gemessenen Werten verglichen.

In Bild 1 bis 3 ist die Leistungsfähigkeit der wässrigen Range-E-Probenlösung und der DMSO-Range-E-Probenlösung im Vergleich zur gravimetrischen Messung in MVS-Verifizierungsplatten mit 96 sowie mit 384 Kavitäten dargestellt. Die Daten in diesen Diagrammen belegen eine weitgehende Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der gravimetrischen und der MVS-Bestimmung; sie zeigen weiterhin, dass die Leistung des MVS bei Range-E-Probenlösung auf Wasser- und DMSO-Basis mit beiden Plattentypen gleich gut ist. Bild 1 belegt außerdem die Fähigkeit des MVS, auch kleine Volumina von nur 10 nl in einer Platte mit 384 Kavitäten zu messen. Dies stellt eine Erweiterung des Messbereichs des MVS dar, dessen Untergrenze bislang bei 30 nl lag.

Die Tabellen 1 und 2 zeigen die Leistungsmerkmale des MVS für Range-E-Probenlösungen auf Wasser- und DMSO-Basis im Volumenbereich von 100…999 nl in Platten mit 96 Kavitäten und im erweiterten Volumenbereich von 10…300 nl in Platten mit 384 Kavitäten.

Fazit
Die hier vorgestellten Daten belegen, dass die 100%ige DMSO- Range-E-Probenlösung das Spektrum des MVS zur Überprüfung von Liquid-Handling-Geräten um eine entscheidende neue Funktion erweitert. Dies wiederum kommt der Nachfrage von Wissenschaftlern in der Arzneimittelforschung nach einer schnellen und zuverlässigen Methode zugute, um Richtigkeit und Präzision ihrer Liquid-Handling-Geräte bei der Dispensierung von Lösungen auf sowohl Wasser- als auch DMSO-Basis zu verifizieren. Die Entwicklung dieser DMSO-Lösung hat außerdem den Markt für MVS-Probenlösungen auf DMSO-Basis mit einem größeren Volumenbereich geöffnet.

Literatur
[1] of Integrating a Volume Verification Method for Liquid Handlers: Applications in Learning Performance Behavior. Bradshaw, Keith J. Albert and John Thomas. Juni 2007, Journal of the Association for Laboratory Automation, S. 172-180.

[2] of Liquid Handling Variability on In Vitro Biochemical Assay Performance: A Look at Protein Binding and Enzyme Assay Classes. Hentz, N. 2013. SLAS.

[3] Volume Transfer Methods to Avoid Reagent Concentration Errors of >50 %. Albert, K.J. Orlando : s.n., 2013. SLAS.

[4] Liquid Handler Performance for Complex or Non-Aqueous Reagents: A New Approach. Keith J. Albert, John Thomas Bradshaw, Tanya R. Knaide, and Alexis L. Rogers. August 2006, Journal of the Association for Laboratory Automation, Bd. 11, S. 172-180.

Autoren
Rachel Parshley, John Thomas Bradshaw PhD, Karl Olson

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