HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp im April Nimm Dir die Zeit und lasse Chromatogramme „sprechen“...
Die zwei Chromatogramme wurden mit einem Abstand von ca. einem Jahr bei identischen chromatographischen Bedingungen aufgenommen, die Säule war in dieser Zeit in Methanol/Wasser gelagert.

Der Fall
Die Chromatogramme „erzählen“ viel – man sollte sich nur die Zeit nehmen, sie etwas bewusst anzuschauen. Das sei nachfolgend anhand der abgebildeten Chromatogramme demonstriert. Dieses Beispiel stammt von der Arbeitsgruppe Prof. Engelhardt, Saarbrücken. Das obere Chromatogramm wurde mit einer neuen Säule aufgenommen, das zweite, nachdem die Säule ein Jahr lang in Methanol/Wasser gelagert wurde. Was fällt auf und wie können wir die Unterschiede erklären?

Die Lösung
Es fallen direkt zwei Dinge auf:

1. Die Elutionsreihenfolge hat sich geändert (s. Peaks Nr. 7 und 9), wobei einige Peaks etwas später (Nr. 2, 4, 5, 6 und 7), einige etwas früher eluieren (Nr. 10, 8 und 9).

2. Die nach vorne gewanderten Peaks sehen – was die Peaksymmetrie betrifft – auch nach einem Jahr gut aus (Nr. 10, 8 und 9), die später eluierenden wiederum sind breiter geworden bzw. haben ein Tailing bekommen (Nr. 2, 4, 5, 6 und 7).

Wenn man nun einen Blick auf die chromatographierten Substanzen wirft und deren Charakter im Zusammenhang mit deren Retentionszeitverschiebung bzw. deren Peakform sieht, gelangt man zu folgenden Feststellungen:

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  • Eine gute Peaksymmetrie auch nach einem Jahr zeigen „unproblematische“ Substanzen: Neutrale Aromaten (Toluol, Ethylbenzol, Benzoesäureethylester), eine schwache Säure (Phenol) und eine inerte Komponente (Thioharnstoff).
    • Peakverbreiterung bzw. Tailing verbunden mit einer Zunahme der Retentionszeit – was zur Elutionsumkehr von Peak 7 und 9 führt – weisen basische Substanzen auf: Anilin, o-m-p-Toluidin, NN-Dimethylanilin.

    Was ist passiert?

Möglicherweise sind ein Teil der C8-Alkylketten hydrolysiert („Bluten“ der Säule), es entstehen zusätzliche Silanolgruppen, die stationäre Phase ist dadurch etwas polarer geworden. Die neutralen, hydrophoben Aromaten, die spät eluieren, gehen nun mit der polarer gewordenen stationären Phase schwächere Wechselwirkungen ein, die Retentionszeit nimmt etwas ab. Die basischen Substanzen dagegen „freuen“ sich, dass jetzt zusätzliche polare Gruppen entstanden sind und bleiben gerne dort hängen. Ergebnis: Verschiebung der Retentionszeit nach hinten sowie Tailing aufgrund der langsamen Kinetik bei der Desorption der Basen von den Silanolgruppen. Es handelt sich hier also um chemisches Tailing; hätte dagegen die Packungsqualität nachgelassen, bekämen wir bei allen Peaks eine schlechte Peakform. Die hier vermutlich stattgefundene Hydrolyse der relativ kurzen C8-Alkylketten wird in einem relativ polaren Milieu (Lagerung hier in Methanol/Wasser) begünstigt.

Das Fazit
• Man kann leicht und schnell zwischen einer Verschlechterung der Packungsqualität (stoffunspezifische Ursache für Tailing/Verschlechterung der Peakform) und einer chemischen Veränderung der Oberfläche (stoffspezifische Ursache für Tailing/Verschlechterung der Peakform) unterscheiden: Wenn die Packungsqualität nachlässt, haben wir eine Verschlechterung der Peakform bei allen Peaks – unabhängig davon, ob sie neutral oder polar/ionisch sind. Das ist hier nicht der Fall, die Säule ist bezüglich der Packungsqualität nach einem Jahr immer noch einwandfrei. Für die Peakverbreiterung/das Tailing bei bestimmten Peaks ist die „Chemie“ der Säule und nicht deren Packungsqualität verantwortlich.
• Die hier besprochenen Veränderungen finden vor allem an der Oberfläche von polaren stationären Phasen und in einem polaren Milieu statt. Also: Relativ polare Phasen wie C8, C4, Diol, CN usw. sollten bei der Lagerung über längere Zeiträume (mehrere Monate) lieber in Acetonitril/Wasser als in Methanol/Wasser gelagert werden.

  • Obwohl wir im vorliegenden Fall eine massive Veränderung der Oberfläche im Sinne der Chemie haben (siehe Unterschied in den zwei Chromatogrammen), bleibt die Peakform der neutralen Aromaten weiterhin gut, auch deren Retentionszeitverschiebung hält sich in Grenzen. Das bedeutet, dass solche Analyte wie z.B. Toluol nicht geeignet sind, solche Veränderungen sichtbar zu machen: Neutrale, „harmlose“ Analyte sehen fast immer tadellos aus. (Frage: Was für Substanzen werden von Säulenherstellern zur Erzeugung der Belegchromatogramme verwendet, die bei neuen Säulen immer beigelegt werden…?). Wenn Sie also ein Interesse daran haben sollten zu erfahren, wie „gut“ Ihre Säule wirklich noch ist, sollten Sie bewusst problematische Substanzen (z.B. Benzylamin) injizieren und nicht solche, die immer gut aussehen. Es sei denn, sie analysieren einfache, neutrale Moleküle. In diesem Fall sind Veränderungen, wie hier besprochen, für Sie kaum relevant.

© by Stavros Kromidas

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