HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Kleine Änderungen – große Wirkung

Von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Im Dezemberheft haben wir uns spaßeshalber folgenden Fall vorgestellt: Sie sollten sich überlegen, welche kleinen („bösen“) Änderungen methodischer und/ oder apparativer Natur Sie be­wusst vornehmen könnten, Änderungen, die eine große Auswirkung zum Beispiel im Chromatogramm (Retentionszeit, Peakform, Peakhöhe, Basislinie usw.) oder an der Anzeige, beispielsweise Druck, haben. Die Frage war anschließend, ob ein mehr oder weniger erfahrener Anwender schnell dahinter kommt, was Sie geändert haben. Findet derjenige es schnell heraus, hätte er diese fiktive Wette gewonnen. Betrachten wir das Ganze seriös und realistisch: Es gibt in der Tat eine ganze Menge Sachen, die wir in der Hektik unbewusst verändern, manipulieren, beeinflussen, oh­ne dass uns das Ausmaß dieser Handlung bewusst ist. Von der wirklich sehr großen Anzahl solcher Eingriffe seien nachfolgend nur einige genannt:

Die Lösung

Nachfolgend werden kleine Hardware-, Methoden-, und sonstige Änderungen inkl. Einstellungen unter Berücksichtigung auch der unmittelbaren Umgebung der HPLC-Apparatur aufgeführt, die eine große Wirkung auf das Ergebnis haben können. In der Klammer steh(en)t jeweils die Auswirkung(en). Folgende Symbole werden verwendet:

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Δ: Änderung

F: Fluss

tR: Retentionszeit

A: Fläche

1. Pumpe:

•Nicht benutzten Kanal mit Luft füllen (Δ F, Δ tR).

•Statt flusskonstanter nun druckkonstanter Betrieb (Δ F, Δ tR).

•Druckbegrenzung (high pressure limit) auf 50 bar setzen (Ärger).

•Kontaminierte Ansaugfritte einsetzen (Geisterpeaks).

•Ansaugfritte zwar im Ultraschallbad mit HNO3 reinigen, aber nicht neutral spülen (schleichende pH-Wert-Änderung des Eluenten, dadurch Δ tR).

•Auslassventil entfernen (Δ F, Δ tR).

•Kontaminierte Einlass-/Aus­lass­ventile einbauen (Geisterpeaks).

•An der Steuerung etwas än­dern (Masterpumpe, PC) (Ärger).

•Alten Kolben (beispielsweise mit Riefen) oder alte Kolbendichtung einbauen (Δ F, Leckage).

2. Δ Eluent:

•pH-Wert bei konstanter Eluentenzusammensetzung ändern (Δ tR, Δ Peakform).

•Eluentenzusammensetzung bei konstantem pH-Wert ändern (s.o.)

•Konstante Eluentenzusam­men­setzung, konstanter pH-Wert, aber andere Säure/Base nehmen (s.o.).

•Ionenstärke erhöhen (s.o.) bzw. statt KH2PO4 K2HPO4 verwenden.

•Eluenten mit Anlayt/UV-Modifiern kontaminieren (Geisterpeaks, Δ Nachweisgrenze).

3. Δ Injektor:

•Injektionsspritze lockern (Δ Injvol, Δ A).

•Die Höhe der Injektionsspritze verändern (Δ Injvol, Δ A).

•Rheodyneventil:

–Hinten Kapillaren (1 <-\> 2 „load, inject“) vertauschen (keine Peaks).

–Andere Schleife einbauen (Peakform).

–Dichtung („Rotorseal“) entfernen (Δ Signal).

–HPLC-Spritze (stumpf) gegen GC-Spritze (spitz) austauschen (Δ A).

–Modell 7125 gegen 7010 austauschen (Δ Signal).

–Ausgang der Waste-Kapillare „einquetschen“ (Leckage, Geisterpeaks).

•Nadel etwas verbiegen (sehr böse!) (Δ Injvol).

•Proben im Karussell um eine Position versetzen bzw.

•Proben vertauschen oder zum Beispiel in das Fläschchen Nr. 21 eine andere Probe einfüllen (Δ tR, Δ Chromatogramm).

•Um die Nadel herum Verschmutzungen anbringen (Geisterpeaks).

•Luft in das System bringen (zusätzliche Peaks, Δ Chromatogramm).

•Purgeventil offnen (Geisterpeaks).

•Purgeflüssigkeit ändern (Δ tR, Δ Peakform).

•Loch der Injektionsspritze verstopfen (kein Signal).

•An den Probefläschchen manipulieren (Kappe am Vial fest verschließen, damit ist kein Druckausgleich möglich, Septen auswechseln bzw. kontaminieren (Geisterpeaks).

4. Säule:

•Kontaminierte Fritten einbauen bzw. Fritte entfernen (Geisterpeaks, Δ Peakform).

•Andere Vorsäule einbauen (Δ tR, Δ Chromatogramm).

•Metallionen injizieren (Tailing bei Komplexbildern).

5. Detektor:

•Einstellungen verändern:

–Datenrateaufnahme (sampling time) (Δ Peakform).

–Zeitkonstante (response time) (s.o.).

–Empfindlichkeit (range) (Δ Signal).

–Spaltbreite, Bandbreite, Referenzwellenlänge (Δ Signal, bei Referenzwellenlänge sogar negativer Peak).

–Wellenlänge (s.o.).

–Internen Ofen ausschalten (Δ tR, Δ Signal).

•Batterie für die Platinen entfernen.

•Lampe anfassen (Δ Signal).

•Alte Lampe einbauen (s.o.).

•Ventilator „etwas“ bedecken (T↑) (Δ tR).

•In der Nähe des Ventilators (Lüfters) eine Lösungsmittelflasche offen stehen lassen (Lösungsmitteldämpfe, dadurch Wellen in der Basislinie, Geisterpeaks).

•Ausgangskapillare (Restriktorkapillare) „etwas“ zumachen (Δ Basislinie).

•Restriktorkapillare entfernen oder gegen einen Teflonschlauch bzw. eine Kapillare mit größerem Innendurchmesser ersetzen (Δ Basislinie).

•Detektorzelle in die andere Flussrichtung drehen (Δ Signal).

•Lampe dejustieren (Δ Signal, Rauschen).

•Pufferlösung in die Zelle einspritzen oder direkt nach dem Puffer Acetonitril pumpen (Δ Signal, Rauschen, Δ Druck durch ausgefallene Salze).

•Größere/kleinere Detektorzelle einbauen (Δ Peakform).

6. Änderungen an der übrigen Apparatur:

•Zusätzlichen oder andere Mischkammer einbauen (Δ tR).

•Degasser ausmachen/kurz­schließen (Ärger mit Luft).

•Schläuche/Peakkapillaren knicken (Ärger mit Luft).

•Bei Verbindungen Fittings von anderen Herstellern verwenden (Rheodyne-Waters), aber dafür sorgen, dass sie dicht sind – ein Totvolumen ist dennoch möglich (Δ Peakform).

•Kapillaren mit anderem Innendurchmesser einbauen (Δ Peakform).

•Position der Säule im Säulenofen verändern (Δ tR).

•PC u n d Detektor erden (Rauschen nimmt zu).

•Ein „stromfressendes“ Gerät oder einfach AD-Wandler/Interface in die Nähe des Kabels von PC zum Detektor stellen (Kriechströme! Δ Rauschen).

•A und B vor/an der Mischkammer tauschen (Δ tR).

7. Sonstiges, Umgebung:

•Methodenparameter an der Software ändern (Ärger).

•Methode unter gleichem Methodennamen, aber bei geänderten Methodenparametern speichern.

•Temperatur am Thermostaten oder an der Klimaanlage verändern (Spikes, Basislinie).

•Größeres Gerät in den gleichen Stromkreis wie die HPLC anbringen und permanent oder periodisch ein- und ausschalten d.h. für Spannungsspitzen sorgen (Spikes).

•Für elektromagnetische Strahlung in der Nähe der HPLC sorgen (mindestens Rauschen).

•Stecker isolieren/lockern (Ärger).

•Dort, wo normalerweise das KH2PO4 steht, NH4H2PO4 hinstellen – beim gewohnten Griff wird unbemerkt die falsche Chemikalie verwendet.

Das Fazit

Viele der oben genannten Fehlgriffe sind mir und anderen Kollegen in den letzten Jahren bei hektischen Situationen tatsächlich passiert: „Schlechtes“ Teil (Dichtung, Fitting, Ventil, Vorsäule usw.) wurde nicht sofort entsorgt und das nächste Mal erneut verwendet, Einstellungen (Methode, Detektor usw.) wurden falsch eingegeben, eine Chemikalie oder ein Lösungsmittel kommt dorthin, wo es nicht hingehört, bei kleinen Umbauten wird nicht der ursprüngliche Zustand hergestellt und vieles, vieles mehr. Natürlich entstehen diese Probleme auch ohne die Einwirkung der Anwender: Luft, Ablagerungen um die Injektionsspritze, das Acetonitril von der Purgeflüssigkeit ist teilweise verdampft, der Serviceingenieur hat bei Reparaturarbeiten etwas verrückt usw. Wenn Sie im Alltag auf Probleme stoßen, die Sie nicht klären können, gehen Sie oben genannte Möglichkeiten kurz durch und überlegen Sie sich, ob nicht vielleicht Sie oder sonst jemand unbewusst der „Täter“ für diese Fehler gewesen sind/ist. Vielleicht ist es mit dem Ziel einer schnelle Diagnose hilfreich, wenn Sie diese Anregungen – um Ihre eigene Erfahrungen ergänzt − in Form einer übersichtlichen „to think“-Tabelle an jede Anlage anbringen.© by Stavros Kromidas

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