Algorithmen in der HPLC-Detektion nutzen

Ein Blick hinter die (Peak-)Kulissen

Digital unterstützte Datenauswertung kann die Interpretation von Chromatogrammen erleichtern. Wie chromatographische Daten automatisiert interpretiert werden können, zeigt der Autor anhand von Algorithmen zur automatisierten Peakerkennung und -integration.

Noch immer schwören zahlreiche Anwender und Anwenderinnen bei der Auswertung ihrer Chromatogramme auf die manuelle Integration der Peaks, weil bei vielen das Vertrauen in die Algorithmen für die automatisierte Integration und Berechnung der Analysenergebnisse scheinbar noch nicht stark genug ist. Das bedeutet aber auch, dass bei komplexen Proben mit mehreren Analyten viel Zeit aufgewendet werden muss, um die Daten gleichbleibend und reproduzierbar auszuwerten. Doch im Hinblick auf strengere Anforderungen und Vorschriften im Zusammenhang mit der Datenintegrität im regulierten Laborumfeld sind automatisierte und vereinfachte Methoden zur Integration komplexer Chromatogramme nachgefragt.

Aktuelle Entwicklungen in der Flüssigchromatographie haben Chromatographiesysteme mit Druckbereichen um 1300 bar für die UHPLC hervorgebracht. Mit diesen Systemen können Analysezeiten durch eine hohe Peakkapazität aufgrund schärferer Peaks und einer höheren Empfindlichkeit deutlich reduziert werden. Wenn beim Probenhochdurchsatz nicht die instrumentelle Analytik, sondern die Datenauswertung zum limitierenden Faktor wird, können intelligente Algorithmen zur Berechnung, Simulation und Extrapolation von Daten zum Einsatz kommen. Derzeit gängige Chromatographie- und Datenauswertungs-Software-Lösungen haben neben den Standardauswerteparametern weitere Funktionen und Algorithmen, die Anwender und Anwenderinnen die Datenauswertung erleichtern können. Lösungen und Algorithmen für diese Problemstellungen werden exemplarisch gezeigt an den Funktionen der Softwarelösungen „i-PeakFinder“, „i-PDeA“ (Intelligent Peak Deconvolution Analysis) und „i-DReC“ (Intelligent Dynamic Range Extension Calculator) von Shimadzu.

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Automatisierte Peakintegration

Bild 1: Die Funktionen des „i-PeakFinders“ machen die Peakerkennung bei überlappenden Peaks (A und B) und bei niedrigem Signal/Rausch-Verhältnis (S/N) (C) sowie das automatische Erkennen von Basisliniendrift (D), Peakbreitenänderung (E) und Untergrundsignaländerung (F) möglich. © Shimadzu

„i-PeakFinder“ ist ein Algorithmus zur automatisierten Peakintegration. Die Integrationsfunktion lässt sich auf ein breites Spektrum komplexer Chromatogramm-Muster anwenden. Große Datenmengen können fehlerfrei verarbeitet werden. So können auch kleine Schulterpeaks genau erkannt und integriert werden (Bild 1). Dabei bleibt die Empfindlichkeit der Peakerkennung im gesamten Chromatogramm erhalten.

Gerade in der Qualitätskontrolle, z. B. im pharmazeutischen Bereich, können Verunreinigungen eine wesentliche Rolle spielen. Durch Flächennormalisierung mit Hilfe verschiedener, einstellbarer Peakbasislinien-Berechnungstypen können Verunreinigungen automatisiert und reproduzierbar für große Datensätze erkannt und ausgewertet werden.

Dynamischen Kalibrierbereich erweitern

Mithilfe von Photodiodenarray-Detektoren (PDA) können zu jedem Zeitpunkt während der Chromatographie UV/Vis-Spektren aufgenommen werden, die einen wichtigen Beitrag zur Datenauswertung liefern. Die Softwarelösung „i-DReC“ ermöglicht die automatische Berechnung von Peakfläche und -höhe, indem die Berechnungsfunktion die Ähnlichkeit der UV/Vis-Spektren im hohen Konzentrationsbereich, in dem das UV-Signal gesättigt ist, ausnutzt.

Überschreitet die integrierte chromatographische Peakfläche einen benutzerdefinierten Schwellenwert, dann verschiebt der Algorithmus das chromatographische Profil automatisch auf eine Wellenlänge des Spektrums mit geringerer UV-Absorption, um eine Signalsättigung zu verhindern. Das Absorptionsverhältnis zwischen der ursprünglichen Zielwellenlänge und der Wellenlänge, welche die „i-DReC“-Funktion verwendet, wird als Korrekturfaktor auf die Peakfläche des erfassten Chromatogramms angewandt, wodurch die Peakfläche und -höhe der ursprünglichen Zielwellenlänge nachberechnet werden.

Der Algorithmus erweitert somit den linearen dynamischen Bereich von Kalibrierkurven erheblich. So wird eine Analyse hoch konzentrierter Proben möglich, ohne dass eine Probenverdünnung und Reinjektion erforderlich ist. In der Beispielanalyse zeigt die Kalibrierkurve von Rhodamin (0,01 g/l bis 10 g/l) mit einem Absorptionsmaximum von 554 nm, wie der lineare Zusammenhang der Kalibrierkurve höheren Konzentrationen sinkt (Bild 2).

Bild 2: Vergleich eines Rhodaminstandards mit UV-Spektrum beim Wellenlängenmaximum von 554 nm (links) mit der Kalibrierkurve bei 554 nm (Mitte) und mit Nachberechnung durch die „i-DReC“-Funktion (rechts). Bild: Shimadzu © Shimadzu

Durch die Verwendung einer definierten Korrekturwellenlänge von 347 nm kann nun der lineare Bereich durch Nachberechnung erweitert werden. Solch eine gleichzeitige Quantifizierung von Verbindungen in niedriger und hoher Konzentration durch die Nutzung des Algorithmus kann die Effizienz der Probenverarbeitung und die Produktivität des Labors steigern, da „Doppelmessungen“ nicht mehr notwendig sind.

„Sehen, was hinter dem Peak liegt“

Bild 3: Messdaten einer Drei-Komponenten-Mischung unter Berücksichtigung der UV-Spektren zu bestimmten Retentionszeiten und Dekonvolution der Spektren unter Anwendung des „i-PDeA“-Algorithmus. © Shimadzu

Selbst mit optimierten chromatographischen Methoden ist es nicht immer möglich, Analyten vollständig zu trennen. Ein Photodiodenarray-Detektor (kurz PDA) ist hier ein nützliches Instrument, um das Vorhandensein einer unerwarteten Nebenkomponente (Verunreinigung) zu bestätigen, da diese ein anderes UV/Vis-Spektrum aufweist als die Hauptkomponente selbst. Die „i-PDeA II“ ist eine chemometrische Datenanalysetechnik, mit der Zielpeaks aus koeluierenden, schlecht getrennten Peaks extrahiert werden können. Der Algorithmus basiert auf der sog. MCR-ALS-Methode (MCR-ALS steht für „multivariate curve resolution-alternating least square”). Mit dieser kann die zeitliche Veränderung der abgeleiteten Werte eines Spektrums bei einer bestimmten Wellenlänge in Form eines abgeleiteten Chromatogramms erhalten werden. Dieses wird zur Abschätzung von Peakprofilen und Spektren, die am dichtesten an den Messdaten liegen, genutzt. Mithilfe solcher komplexen Algorithmen können Verunreinigungen, die z. B. an der abfallenden Flanke eines Hauptpeaks auftauchen, identifiziert und sogar quantifiziert werden. Die Messung eines Drei-Komponenten-Gemisches (Bild 3) veranschaulicht, wie der Algorithmus die unterschiedlichen spektralen Daten der koeluierenden Verbindungen auseinanderrechnet und in einzelne Spektren zerlegt. Die daraus extrahierten Spektren und Peaks können integriert und die Komponenten quantifiziert werden. Darüber hinaus ist der Algorithmus auch in der Lage, Spektren von Isomeren mit gleichem Molekulargewicht statistisch auseinanderzurechnen.

Fazit

Die hier vorgestellten Algorithmen zur automatisierten Peakerkennung und -integration sowie zur Verbesserung der Kalibrierung zeigen, wie chromatographische Daten automatisiert interpretiert werden können. Diese Softwarelösungen unterstützen auch bei der Identifizierung und Quantifizierung koeluierender Verbindungen mithilfe von spektralen Daten aus Photodiodenarray-Detektoren. Digital unterstützte Datenauswertung kann nicht nur die Interpretation von Chromatogrammen erleichtern, sondern Anwendern und Anwenderinnen im Labor Zeit sparen und höhere Effizienz in der Analytik bringen.

AUTOR
Stephan Neumann
Produktspezialist HPLC
Shimadzu Deutschland, Duisburg
Tel.: 0203 7687-0
info@shimadzu.de
www.shimadzu.de

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