HPLC-Tipp

Sind ein kleines "Delay Volume" der Apparatur und/oder ein kleines Volumen der Mischkammer immer "gut"? Oder: Was ein paar "Mikroliterchen" alles bewirken können

Der Fall:
Im Zuge der Verbreiterung von U(H)PLC-Geräten warten die Hersteller mit immer kleineren Verweilvolumina (Verweilvolumen, auch: Verzögerungsvolumen, „Delay Volume“, „Dwell Volume“, das ist das Volumen von der Mischkammer bis zur Säule) bzw. Volumina der Mischkammer (35...ca. 60 µl) auf. Da ist zunächst nichts dagegen einzuwenden. Kleine Volumina können jedoch auch Nachteile mit sich bringen. Dabei denke ich im Moment nicht an eine erhöhte Gefahr für Niederschläge im Falle von starken Puffern. Nein, vielmehr geht es mir hier um Probleme, die mit der Trennung selbst zu tun haben, z.B. eine schlechte Peakform, eine mangelnde Selektivität und das „Verschwinden“ von Peaks. Schauen wir uns nachfolgend einige Fälle sowie entsprechende Lösungsansätze an.

Die Lösung
Fall 1: Fronting

Bild 2: Einfluss des Verweilvolumens einer Gradientenanlage auf die Anzahl der Peaks im Chromatogramm, Details siehe Text.

Eine Probe ist in MeOH gelöst, es werden 20 µl injiziert, die Anfangsbedingungen des Eluenten (linearer Gradient) lauten 30/70 Puffer/MeOH. Die Methode läuft an zwei Geräten unterschiedlicher Hersteller. Am Gerät A ergibt sich ein symmetrischer Peak, am Gerät B wird ein Fronting beobachtet, die Retentionszeit ist quasi identisch. Wird dagegen als Probenlösungsmittel der Anfangseluent verwendet, ergibt sich an beiden Geräten ein symmetrischer Peak.

Erklärung:

Gerät B hat ein etwas kleineres Geräte-Gesamtvolumen und die Zeit für eine ausreichende Durchmischung zwischen dem starken Probenlösungsmittel MeOH und dem schwächeren (schwach im Sinne der RP-HPLC bedeutet mehr Wasser) Anfangseluenten reicht nicht aus, Fronting ist bekanntlich die Folge. Die Lösung wäre hier verdünnen oder weniger injizieren, z.B. 5 µl, das sind einfache Möglichkeiten, die im vorliegenden Fall auch tatsächlich funktionieren würden. In einem stark reglementierten Umfeld jedoch sind solche Änderungen nicht schnell umsetzbar:

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  • Änderung in der PV einer validierten Methode? Nicht ohne weiteres möglich.
  • Eine größere Mischkammer oder eine dickere Kapillare (Erhöhung des Totvolumens) verwenden? Im Falle von mehreren Geräten womöglich beträchtlicher Qualifizierungsaufwand.
  • Ein neues Gerät kaufen?...

Man sieht: Ein paar Mikroliter können einer(m) das Leben schon schwer machen…

Fall 2: Mangelnde Selektivität

Bei einem kleinen Verweilvolumen erreicht eine in der Mischkammer aktuell erzeugte Mischung die Säule schnell, die Verzögerung ist gering. Je größer das Verweilvolumen ist, umso länger gestaltet sich die isokratische Stufe zu Beginn des Gradienten, es dauert länger bis die aktuelle Eluentenzusammensetzung in der Säule ankommt und dort wirksam wird. Die Folge (denke an Methodentransfer!) kann vielfach sein: Änderung der Retentionszeit, der Auflösung, der Peakform, der Elutionsreihenfolge. Diese Verzögerung durch die isokratische Stufe zu Beginn kann jedoch die Trennung auch positiv beeinflussen, siehe Bild 1 (Bild 1 und 2 wurden freundlicherweise von Dr. Hans-Joachim Kuss, Uniklinik München, zur Verfügung gestellt).

Bei einem kleinen Verweilvolumen, unteres Bild, erscheinen zwischen der 3. und der 4. Minute zwei Peaks. Ist dagegen das Verweilvolumen größer, oberes Bild, und damit die isokratische Stufe zu Beginn länger, haben wir nicht nur eine Verlängerung der Retentionszeit, sondern es erscheint zwischen den zwei besagten Peaks ein weiterer Peak bei ca. 5,3 min.

Fall 3: Ein weiterer Peak…

Siehe Bild 2: Ist das Verweilvolumen minimal größer, ist auch die Verweilzeit („Delay Time“) einige Sekunden länger (siehe Pfeil am linken Bild) und in der Spülphase des Gradienten erscheint Peak Nr. 7. Bei einem kleineren Verweilvolumen, siehe Bild rechts, fehlt dieser Peak.


Das Fazit
Folgende Aussagen/Fragen (stellvertretend!) sind wirklich nicht neu, dennoch stets aktuell und sie sollten vor einer Anschaffung sinnvollerweise beantwortet werden: Was habe ich mit der Anlage wirklich vor? Mit wem muss ich meine Ergebnisse vergleichen? Wird das Gerät für verschiedene Fragestellungen eingesetzt oder brauche ich eine robuste Anlage für die Routine? Stellen diese verbesserten Spezifikationen für mich tatsächlich einen Vorteil dar? Wurde bei der Validierung der von mir in der Zukunft zu anwendenden Methode das von mir anzuschaffende Gerät überprüft? Zum Schluss folgende Empfehlung: Wenn bei einer Methodenübernahme das Chromatogramm nicht zu reproduzieren ist, denken Sie nicht nur an evtl. Unterschiede in der „Chemie“ (Säule, pH-Wert usw.), sondern fragen Sie sich, ob die zwei Anlagen 100, aber wirklich 100 % identisch sind (PEEK/Stahlkapillaren, Stahl/Messingnadel, Volumen und Geometrie der Mischkammer…).

© by Stavros Kromidas
www.kromidas.de

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