microRNA-Hybridisierung

Ungefähr 5 % aller neu diagnostizierten metastasierenden Krebserkrankungen sind Karzinome mit unbekanntem Primärtumor. Auch moderne immunhistochemische und radiologische Methoden können in diesen Fällen die Lage des Primärtumors nicht ausfindig machen (Bild 1). Da die erfolgreiche Krebsbehandlung maßgeblich von einer frühen Identifikation des Primärtumors abhängt, haben die betroffenen Patienten schlechte Prognosen: Die mittlere Überlebensrate liegt bei drei bis sechs Monaten, die Ein-Jahr-Überlebensrate beträgt weniger als 25 %.

Wissenschaftler haben nun ein molekulares Klassifizierungsinstrument entwickelt, mit dem unbekannte Primärtumore nachgewiesen werden können. Dafür eignen sich microRNAs besonders gut, weil ihre Expressionsmuster zur Klassifizierung spezifischer Krebsarten herangezogen werden können. In der folgenden Fallstudie wurden sie genutzt, um den Tumortyp eines Patienten mit unbekanntem Primärtumor aus einer Gewebeprobe einer Lymphknotenmetastase zu analysieren.

Fallstudie mit unbekanntem Primärtumor

Zunächst entwickelten die Wissenschaftler spezifische Tumor-Klassifikatoren, um später die Proben von Karzinomen mit unbekanntem Primärtumor bestimmten Gewebeklassen zuordnen zu können. Dazu verwendeten sie mehr als 500 Tumorgewebeproben und Proben aus angrenzenden, gesunden Geweben – sowohl aus gefrorenen als auch aus Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Sektionen. Untersucht wurden die 18 Gewebearten, welche die häufigsten Ursprungsgewebe für Karzinome mit unbekanntem Primärtumor repräsentieren.

Im ersten Schritt isolierten die Forscher Gesamt-RNA aus den Proben mittels Guanidin-Isothiocyanat/Phenol-Chloroform-Extraktion. Im Anschluss analysierten sie die microRNA-Expression aus 1 µg Gesamt-RNA auf dem miRCURY LNA^TM Array mit der HS Pro^TM Hybridization Station. (Ausführliches Protokoll unter www.tecan.com und http://www.exiqon.com).

Die miRCURY LNA^TM microRNA Array Microarray-Slides wurden mit dem Scan-Array^TM 4000 XL Scanner (Packard Biochip Technologies, USA) gescannt. Zur Bildanalyse wurde die ImaGene^TM Software (BioDiscovery, Inc., USA) benutzt. Die Normalisierung der Fluoreszensintensitäten erfolgte mit dem LOWESS(LOcally WEighted Scatterplot Smoothing)-Regressionsalgorithmus.

Identifizierung über Klassifikatoren

Die Wissenschaftler bestimmten die micro-RNA-Expressionsprofile aller 500 Proben und speicherten sie in einer Expressionsdatenbank. Anhand von hierarchischen Clusteranalysen – kontrolliert und unkontrolliert – erstellten sie im Anschluss die Klassifikatoren zur Unterscheidung der Tumorgruppen. Mithilfe dieser Klassifikatoren konnte das Team bislang unbekannte Primärtumoren identifizieren. Dazu verglichen sie die microRNA-Profile der entsprechenden Gewebeproben mit den Expressionsprofilen aus der Datenbank. Eine Detailanalyse der Ergebnisse zeigte, dass bereits sieben microRNAs ausreichten, um einen zuverlässigen Karzinom-Klassifikator zu erzeugen (Bild 2).

Primärtumor einer Lymphknotenmetastase

Diese Tumorklassifikatoren nutzten die Wissenschaftler, um den Primärtumor einer Lymphknotenmetastasen-Probe zu bestimmen. Mit einer einfachen Clusteranalyse konnten sie zeigen, dass das microRNA-Profil der Lymphknotenmetastase zu einem kolorektalen microRNA-Cluster gehört (Bild 3). Somit wurde ein Kolorektalkarzinom identifiziert und der Darm als Ursprung der Lymphknotenmetastase eindeutig bestimmt.

Derzeit arbeitet das Forscherteam an einer Erweiterung der Klassifikatoren um mehr als 150 000 Proben aus der Tumor-Bank von Exiqon, damit auch histologische Subtypen in die Analysen eingeschlossen werden können.

Die Array-Daten aus dieser Studie wurde durch microRNA-in-situ-Hybridisierung mit gewebespezifischen Markern über die LNA^TM-Technologie (siehe Infokasten) validiert. Das entsprechende Protokoll steht auf http://www.exiqon.com zur Verfügung. Für alle in-situ-Hybridisierungsansätze verwendeten die Wissenschaftler die Freedom EVO^® Assay Workstation von Tecan.

Bild 4 zeigt die Lokalisierung von microRNAs in gesundem Darmgewebe und in Darmkrebsgewebe. Es ist gut zu erkennen, dass das Krebsgewebe im Vergleich zu gesundem Gewebe mehr microRNA enthält. Diese ist vor allem in den an den Tumor grenzenden, fibroblastenähnlichen Zellen lokalisiert.

Automatisierung der Hybridisierung

Um reproduzierbare und verlässliche Daten zu erzeugen, ist die Automatisierung der komplexen experimentellen Abläufe der Hybridisierungsexperimente unerlässlich. Mit den Hybridisierungsstationen der Serie HS Pro^TM von Tecan können Microarray-Hybridisierungsexperimente auf Microarrays vollautomatisch durchgeführt werden. Durch eine Hybridisierungskammer, die den Träger von oben abdichtet, transportiert die Hybridisierungsstation die Waschlösung aktiv auf und von der Trägeroberfläche, was eine hohe Wascheffizienz gewährleistet. Es gibt zwei unterschiedliche Ausführungen der HS Pro^TM Hybridisierstation: Die kleine Ausführung, HS 400 Pro^TM, erfasst bis zu vier Slides. Die größere Ausführung, HS 4800 Pro^TM, kann bis zu 48 Slides bearbeiten.

Während der Hybridisierung wird die Probe einem Mischvorgang unterzogen. Mit dem ABS^TM(Active Bubble Suppression)-System sorgt die Hybridisierungsstation dabei für eine einheitliche blasenfreie Inkubation der Probe. Verglichen mit einer statischen Hybridisierung wird durch die Mischbewegung eine hohe Spezifität, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erzielt. Die spezielle Trocknung (On-Slide Nitrogen Drying procedure, OSND^TM) führt zu einem niedrigen und einheitlichen Hintergrund. Im Anschluss an die OSND^TM können die Slides sofort eingescannt werden.

Die HS 4800 Pro^TM Hybridisierstation stellt in Kombination mit dem miRCURY LNA^TM Array ein leistungsstarkes System zur Durchführung qualitativ hochwertiger microRNA-Expressionsanalysen dar. Wie die beschriebene Fallstudie zeigt, erlaubt die Hybridisierungsstation das hochspezifische Binden der Sonden, wodurch eine hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit erreicht wird.

Literatur
[1] Pentheroudakis et al.: „Cancer of unknown primary site: missing primary or missing biology?“ Oncologist 2007; 12: 418–425.