DNA-basierte Mikroskopie

Schnelle Superauflösungsmikroskopie

Die Technik DNA-Paint nutzt DNA-basierte Sonden, um kleinste zelluläre Strukturen sichtbar zu machen, doch war ihr Einsatz bisher durch die vergleichsweise langsame Bildaufnahme limitiert. Wissenschaftler des Max-Planck-Instituts für Biochemie haben eine Methode gefunden, mit der sich die Abbildungsgeschwindigkeit deutlich erhöht.

Die superauflösende Mikroskopietechnik DNA-Paint ermöglicht die Detektion von feinen Strukturen in der Zelle, hier: Mikrotubuli, Bestandteile des Zytoskelettes. © Florian Schueder, MPI für Biochemie

Fortschritte in der Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen es, biologische Prozesse unterhalb der klassischen Beugungsgrenze des Lichtes sichtbar zu machen. Eine Variante dieser sog. Superauflösungstechniken ist „DNA-PAINT“, die von Ralf Jungmann, Forschungsgruppenleiter für „Molekulare Bildgebung und Bionanotechnologie“ am Max-Planck-Institut für Biochemie und Professor für Experimentalphysik an der LMU, und Kollegen entwickelt wurde. „DNA-Paint ermöglicht es, super-­aufgelöste Bilder mit technisch vergleichsweise einfachen Mikroskopen zu erhalten“, sagt Jungmann. Um das zur Rekonstruktion superaufgelöster Bilder notwendige „Blinken“ von Zielmolekülen zu erreichen, werden diese bei DNA-Paint mit kurzen DNA-Strängen markiert. In Lösung befindet sich ein komplementärer, farbstoffmarkierter DNA-Strang, der wiederholt an den Zielstrang an- und abbindet und das Ziel zum „Blinken“ bringt. So erreicht DNA-Paint sehr hohe Ortsauflösungen von besser als 10 nm und kann durch die Nutzung verschiedener DNA-Sequenzen, quasi Barcodes, viele Zielmoleküle gleichzeitig abbilden.

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„In den letzten Jahren haben wir die Technik in vielen Bereichen verbessert. Eine große Einschränkung hat uns jedoch immer daran gehindert, DNA-Paint für biologisch relevante Hochdurchsatzstudien einzusetzen: Die vergleichsweise langsame Bildaufnahme“, sagt Jungmann. Klassische DNA-Paint-Experimente nehmen üblicherweise mehrere zehn Minuten bis hin zu Stunden in Anspruch. „Wir haben uns genau angeschaut, warum das so lange dauert“, so Florian Schüder, Erst­autor der Studie und Mitarbeiter im Labor von Jungmann. Hierzu wurde der Einfluss der DNA-Sequenz und der Basenabfolge auf die Geschwindigkeit der Hybridisierung, also das Ausbilden der Doppel­helix, untersucht.

Optimiertes DNA-Sequenzdesign
Der farbstoffmarkierte Einzelstrang, bei DNA-Paint auch „Imager“ genannt, besteht generell aus den Grundbausteinen der DNA, den vier Basen Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C). Der Einfluss der Basenkomposition und Länge der Einzelstränge auf die Bindezeit ist recht gut verstanden: Je länger der Doppelstrang und je mehr GC-Basenpaare in der Sequenz vorhanden sind, desto stabiler ist der DNA-Duplex und desto länger die Bindezeit. Der Einfluss auf die Geschwindigkeit der Duplexbildung, und damit die Blinkgeschwindigkeit in DNA-Paint, ist jedoch deutlich schlechter untersucht.

Darstellung des optimierten Farbstranges. Durch die neu konzipierte Abfolge der Basenpaare kann die Bindefrequenz erhöht werden und Bilder schneller aufgenommen werden. © Susanne Vondenbusch © MPI für Biochemie

Hier konnten die Forscher nun zeigen, dass die Ausbildung intramolekularer Haarnadelkonformationen, also das Falten mit sich selbst, in kurzen Strängen durch die Reduktion auf zwei Basen (z. B. nur T und C statt A, T, C, G) vollständig unterbunden werden kann. „Wir haben jetzt die Stränge so entworfen, dass wir nur ein sogenanntes ‚Zweibuchstabenalphabet‘, z. B. nur T und C oder nur A und G, benutzen. So konnten wir die Bindefrequenz bereits um einen Faktor 5 steigern“, erklärt Schüder. „Durch weitere Optimierungen am verwendeten Puffersystem konnten wir zusätzlich einen Faktor 2 rausholen, so dass wir jetzt 10-mal schneller Bilder aufnehmen können“.

Ralf Jungmann fasst zusammen: „Mit der in dieser Studie gezeigten 10-fach höheren Abbildungsgeschwindigkeit eröffnen wir ein neues Kapitel superaufgelöster DNA-basierter Mikroskopie. Dies sollte es uns nun erlauben, DNA-Paint für Hochdurchsatzstudien mit biologischer und biomedizinischer Relevanz z. B. in der Diagnostik einzusetzen.“

Publikation:
F. Schüder, J. Stein,
F. Stehr, A. Auer, B. Sperl, M.T. Strauss, P. Schwille und R. Jungmann: An order of magnitude fas­ter DNA-PAINT imaging by optimized sequence design and buffer conditions. Nature Methods, Oktober 2019; https://doi.org/10.1038/s41592-019-0584-7

Quelle: Max-Planck-Institut für Biochemie

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