Probenvorbereitung

Monoklonale Antikörper: schnell und sicher analysiert

Standardisierte Probenvorbereitung und Kopplung von Mikro-HPLC mit Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) für eine schnelle Analytik von Spurenstoffen.
Bild 1: Das System Nexera Mikros von Shimadzu. © Shimadzu

Seit etwa 30 Jahren gibt es pharmazeutisch hergestellte monoklonale Antikörper (mAbs). Sie sind vielfältig medizinisch nutzbar und werden in der Diagnostik wie auch in der Therapie eingesetzt. Krankheiten, die mit monoklonalen Antikörpern behandelt werden, sind beispielsweise chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn und Colitis ulcerosa) oder verschiedene Krebserkrankungen, wie etwa Brustkrebs.

LC-MS/MS-Bestimmung von monoklonalen Antikörpern

Ein klassisches Verfahren monoklonale Antikörper im Blut zu analysieren, sind Ligandenbindungstests (Ligand Binding Assay, LBA). Die Methodenerstellung ist zeitintensiv, teuer und fehleranfällig, da es hier zu einer Kreuzreaktion kommen kann. Neben LBAs werden auch zunehmend massenspektrometrische Bestimmungen von therapeutischen monoklonalen Antikörpern im Serum oder Plasma eingesetzt, etwa für pharmakokinetische Studien in der präklinischen, klinischen und therapeutischen Phase. Diese Methode bietet eine höhere Selektivität gegenüber LBAs. Darüber hinaus erfordert der LC-MS/MS-Ansatz weniger Methodenentwicklungsarbeit; sie ist bereits innerhalb von Tagen statt mehrerer Monate abgeschlossen. Das von Shimadzu entwickelte nSMOL-Antikörper-Kit standardisiert hierbei den Probenvorbereitungsworkflow und verbessert die Empfindlichkeit des massenspektrometrischen Assays. nSMOL steht für: nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis.

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Bild 2: Das nSMOL-Kit (nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis). © Shimadzu

Wie funktioniert das nSMOL-Kit?

Das Ready-to-use nSMOL-Kit ermöglicht die selektive Proteolyse von Antikörpern. Hierbei werden nach der Anreicherung über Immunglobuline die FAB-Regionen (antigen-binding fragment) von mAbs mit Hilfe von Trypsin-immobilisierten Nanopartikeln proteolytisch abgebaut (Bild 2).

Sensitivitätserhöhung durch Nexera Mikros

Die Peptide können anschließend über MRM-Analyse mittels Triple-Quadrupol-Massenspektrometer quantifiziert werden. Aus Erfahrung bieten kleinere Flussraten höhere Sensitivitäten; hingegen führen höhere Flussraten zu einer höheren Robustheit des Systems. Die Nexera Mikros als Micro-Flow LC-MS-System vereint hierbei „das Beste aus zwei Welten“ und bietet eine gesteigerte Empfindlichkeit und eine hohe Robustheit.

Bild 3: Kalibrierkurve der Trastuzumab-Bioanalyse. © Shimadzu

Das System deckt einen hohen Bereich an Flussraten ab: für Analysen im Mikro- (1 bis 10 µl/min) bis in den Semi-Mikro-Bereich (100 bis 500 µl/min). Durch die Verbindung der Nexera Mikros (s. Bild 1) mit den Triple-Quadrupol-LCMS-Systemen von Shimadzu können die Signalintensitäten um den Faktor 12 erhöht werden (im Vergleich zu konventioneller LC-MS), wodurch sich das System hervorragend für die Spurenbestimmung von Peptiden eignet.

Analyse von Trastuzumab in menschlichen Plasmaproben

Tabelle 1: Ergebnisse von QC-Proben. Die Proben der 1. und 2. Qualitätskontrolle wurden über einen Zeitraum von zwei Tagen analysiert, wobei jeder Konzentrationssatz fünfmal analysiert wurde. © Shimadzu

Trastuzumab ist ein monoklonaler Antikörper, der als Arzneistoff bei bestimmten Formen des Brustkrebses eingesetzt wird. Plasmaproben wurden mit Trastuzumab versetzt, mit dem nSMOL-Kit vorbereitet und mit der Nexera Mikros in Kombination mit dem LCMS-8060 Triple-Quadrupol Massenspektrometer analysiert, ein System, spezialisiert auf höchste Sensitivität und Ultra-Fast-Technologien. In Bild 3 ist die Kalibrierkurve zu sehen.

Bild 4: Chromatogramme von Trastuzumab bei verschiedenen Konzentrationen (Flussrate: 4 µl/min). © Shimadzu

Die Signaturpeptide des Trastuzumabs konnten mit der Nexera Mikros im Bereich von 0,00763 – 62,5 μg/ml mit einer guten Linearität von R² > 0,99 und einer exzellenten Präzision (s. Tabelle 1) bestimmt werden. In Bild 4 werden Chromatogramme von Trastuzumab bei verschiedenen Konzentrationen gezeigt.

Fazit

Mit Hilfe des von Shimadzu entwickelten Probenvorbereitungskits nSMOL und Kopplung von Mikro-HPLC mit Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie können monoklonale Antikörper sehr sensitiv quantifiziert werden. Ebenso wird der Probenvorbereitungsworkflow standardisiert. Die Methodenentwicklungsarbeit verkürzt sich von Monaten auf wenige Tage. Das Ready-to-use-Kit ist für eine Vielzahl von pharmazeutischen Antikörpern anwendbar.

AUTORIN
Vanessa Breutner
Produktspezialistin HPLC/BioTech
Shimadzu Deutschland
info@shimadzu.de
www.shimadzu.de

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