Exzision viraler Vektoren aus iPS-Zellen unter Verwendung von zellmembrangängigem TAT-Cre-Protein

Effiziente Gewinnung transgenfreier iPS-Zellen

In diesem Artikel beschreiben wir die effiziente Erzeugung von transgenfreien murinen und humanen iPS-Zellen durch Verwendung eines Cre-exzidierbaren polycistronischen lentiviralen Vektors, der die "Stammzellkassette" (STEMCCA™ cassette) exprimiert, die alle vier Transkriptionsfaktoren enthält, gefolgt von der Exposition der voll reprogrammierten iPS-Zelle gegenüber dem rekombinanten zellmembrangängigen TAT-Cre-Protein. Zusätzlich stellen wir eine einfache und robuste PCR-Strategie zur raschen Identifizierung von deletierten Klonen direkt aus primären iPS-Zellkolonien vor.

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) bieten ein hohes Potenzial für die regenerative Medizin sowie für Krankheitsmodelle oder das Testen potenzieller Medikamente im Labor. Während Wissenschaftler diese Zellen für eine breite Palette an Anwendungen einsetzen, können die herkömmlichen Methoden zur Erzeugung von iPS-Zellen ineffizient und zeitaufwändig sein.

Die ersten iPS-Zellen wurden im Jahr 2007 hergestellt, als Wissenschaftler Hautzellen mit vier Transkriptionsfaktoren (Oct-4, Klf4, Sox-2 und c-Myc) infizierten [1]. Die Konversion dieser somatischen Zellen zu iPS-Zellen erforderte eine simultane Co-Infizierung mit vier separaten retroviralen Expressionsvektoren. Jeder Vektor trug einen der Transkriptionsfaktoren, was zu einer hohen Anzahl an genomischen Integrationen führte, die ein Sicherheits-risiko darstellen oder zu einer heterogenen Zellpopulation führen könnten. Alternative Methoden verwendeten zur Einschleusung der Transkriptionsfaktoren Plasmide und nicht-integrierende adenovirale Vektoren, doch diese Ansätze erwiesen sich als weniger effizient als der Einsatz retroviraler Vektoren.

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Eine Neuentwicklung ermöglichte es wenig später, unter Anwendung eines einzelnen polycistronischen lentiviralen Vektors, humane und murine iPS-Zellen zu erzeugen. Die STEMCCA¿-Reprogrammierungskits (Merck Millipore, Darmstadt) verwenden einen einzelnen Lentivirusvektor, der eine "Stammzellkassette" mit allen vier Transkriptionsfaktoren exprimiert. Durch die Verwendung eines einzelnen Vektors reduziert sich die Anzahl der für die Ableitung von iPS-Zellen erforderlichen Virusintegrationen erheblich; in manchen Fällen können iPS-Zell-Klone mit nur einem einzelnen Virusintegranten isoliert werden [2].

Die Reprogrammierung somatischer Zellen mittels viraler Transduktion definierter Transkriptionsfaktoren ist nach wie vor eine weit verbreitete und effiziente Methode der Gewinnung von iPS-Zellen. Das Vorhandensein viraler Transgene in iPS-Zellen ist jedoch unerwünscht, da sich dadurch die Möglichkeit für eine insertionelle Mutagenese erhöht, was zu maligner Transformation führt und nachweislich auch das Differenzierungspotenzial beeinträchtigt. Hinsichtlich dieses Punktes sind verschiedene Strategien, einschließlich der Verwendung nicht-integrativer Viren, RNA-Transfektion, Proteintransduktion und ortsspezifischer Rekombinasen, zum Einsatz gekommen, um eine Exzision der Transgene nach der Reprogrammierung durchzuführen.

Material und Methoden

Zur Validierung der TAT-Cre-Transduktion und der Rekombinationsaktivitäten wurde ein Schnelltest verwendet. Eine 293T-Zelllinie mit stabiler Expression eines doppelt fluoreszierenden Reporterkonstrukts wurde zur Überwachung der Cre-Rekombination verwendet (Bild 1).

Exzision humaner iPS-Zellen
Humane iPS-Zellen wurden in einen Feeder-freien Zustand übergeführt. Einen Tag vor der Passagierung wurde ein Rho-assoziierter Proteinkinase-(ROCK-)Inhibitor zugefügt, und die Zellen wurden zu einer Einzelzellsuspension dissoziiert. 50 000 ... 100 000 Zellen wurden in jede Vertiefung einer 12-Well-Mikrotiterplatte überführt. Die Platte wurde über Nacht inkubiert, um die Anheftung der Zellen zu ermöglichen; danach erfolgte die Inkubation mit 2 ... 5 mM des TAT-Cre-Proteins (Bild 2). Nach 7 ... 9 Tagen begannen die Kolonien erneut zu erscheinen und konnten expandiert werden. Danach wurde die genomische DNA für die Analyse mittels quantitativer Real-time-PCR extrahiert (Bild 3).

Exzision muriner iPS-Zellen
Die Exzision muriner iPS-Zellen erfolgte nach zwei Protokollen, einem mit Feeder-basierter Kultur und einem mit einer serumfreien, Feeder-freien Kultur. Für das Feeder-basierte Kulturprotokoll wurden die murinen iPS-Zellen auf einer pMEF-Feeder-Schicht in mESC-Medium angezüchtet. Die Zellen (miPSC und pMEF) wurden mit Accutase®-Lösung zu einer Einzelzellsuspension dissoziiert. Danach wurden 10 000 Zellen während 2 ... 4 h bei 37 °C mit 4 mM TAT-Cre in 200 ml mESC-Medium in einer 96-Well-Mikrotiterplatte behandelt. Im Anschluss daran wurden die Zellen in einer frischen, mit pMEF-Feeder beschichteten 6-Well-Platte ausplattiert. Nach 5 ... 6 Tagen begannen die Kolonien erneut zu erscheinen und konnten selektiv expandiert werden. Abschließend wurde die genomische DNA für die Analyse mittels quantitativer Real-time-PCR extrahiert (Bild 4).

Beim Feeder-freien Kulturprotokoll wurden die murinen iPS-Zellen für 2 ... 3 Passagen in einem ESGRO®-2i-Medium kultiviert. Die murinen iPS-Zellen wurden mit Accutase®-Lösung zu einer Einzelzellsuspension dissoziiert, und 100 000 Zellen wurden auf Gelatine-beschichteten 6-Well-Mikrotiterplatten ausplattiert. Danach wurden die Zellen über Nacht mit 4 mM TAT-Cre in einem ESGRO®-2i-Medium inkubiert. Nach 9 ... 10 Tagen begannen die Kolonien erneut zu erscheinen und konnten selektiv expandiert werden. Schließlich wurde die genomische DNA für die Analyse mittels quantitativer Real-time-PCR extrahiert.

Ergebnisse
Es konnte eine hoch-effiziente Exzision nach 1- bis 2-stündiger Exposition der iPS-Zellen mit 4 ... 6 mM TAT-Cre gezeigt werden: 100 % bei murinen und bis zu 60 % bei humanen iPS-Zellen. Der mittels Proteintransduktion erzielte hohe Effizienzgrad steht in deutlichem Gegensatz zu den mithilfe der Elektroporation einer Plasmid-exprimierenden Cre-Rekombinase (<10 %) und auch mittels Adenovirus-exprimierender Cre-Rekombinase erzielten Ergebnissen; letztgenanntes Verfahren zeigte sich für die Erzeugung muriner, nicht aber humaner iPS-Zellen effektiv.

Die Erzeugung transgenfreier iPS-Zellen erforderte etwa zwei Wochen ab dem Zeitpunkt der Zugabe von zellmembrangängigem TAT-Cre-Protein. Faktorfreie humane und murine iPS-Zellen wiesen entsprechende morphologische Charakteristika und immunchemische Färbeeigenschaften pluripotenter Zellen auf. Faktorfreie humane iPS-Zellen besaßen einen normalen Karyotyp und waren in der Lage, in vivo in Zellen aller drei Keimblätter zu differenzieren (Bild 5).

Das Protokoll war einfach: Die direkte Zugabe von zellmembrangängigem TAT-Cre-Protein ermöglichte eine robuste Exzision und erzeugte transgenfreie iPS-Zellen. Zudem konnten die deletierter Klone mithilfe eines qPCR-Screeningtests schnell identifiziert werden.

Schlussfolgerung
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir ein robustes System zur hoch-effizienten Exzision viraler Vektoren aus iPS-Zellen mithilfe eines zellmembrangängigen TAT-Cre-Proteins zeigen konnten. Die effiziente Einbringung eines aktiven rekombinanten Cre-Proteins in Säugetierzellen hat breite Anwendungsmöglichkeiten für die Reprogrammierung somatischer Zellen und dient darüber hinaus auch als leistungsstarkes Instrument zur schnellen genetischen Manipulaton von Säugetiergenomen.

Angesichts der Tatsache, dass induzierte pluripotente Stammzellen sowohl im klinischen Bereich als auch in der Forschung neue Möglichkeiten geschaffen haben, ist eine Verbesserung der Erzeugung dieser speziellen Zellen von entscheidender Bedeutung. Patienten-spezifische Zellerneuerungstherapien sind bereits in der Entwicklung, und Wissenschaftler verwenden iPS-Zellen für Krankheitsmodelle und Toxizitätsscreenings.

Stammzellen ermöglichen die Konstruktion von Humanmodellen komplexer Krankheiten und gewähren wichtige Einblicke, die zu verstärkt personalisierten Ansätzen in der Medizin führen.

Literatur
[1] Takahashi, K, Tanabe, K et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factor. Cell. 2007; 131: 861-72.
[2] Sommer, CA et al. iPS cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 2009; 27(3): 543-9.

Autoren:
Vi Chu, Min Lu, Ming Li, Naomi Guyette
EMD Millipore, 290 Concord Rd, Billerica, MA 01821, USA. Korrespondenzautor: vi.chu@emdmillipore.com.
Kadari Asifiqbal, Sandra Meyer, Frank Edenhofer
Institute of Reconstructive Neurobiology, Universität Bonn, Medizinische Fakultät Bonn, Deutschland.

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