Viabilitätsprüfung in 3D-Zellkulturen

Leben sie noch?

Biolumineszenz-Assays erlauben die Endpunkt- und Echtzeit-Untersuchung von Sphäroiden und können zur Bestimmung der Viabilität in magnetisch erzeugten 3D-Kulturen herangezogen werden.

Dreidimensionale und hochorganisierte Mikrogewebe spiegeln die natürliche Umgebung von Zell- und Gewebeverbänden besser wider als traditionelle Monolayer-Zellkulturen: Stoffwechselprozesse, Transportvorgänge und das Zusammenspiel von Signalnetzwerken können erst in ihrer organtypischen Mikroumgebung realistisch untersucht werden. Durch die große Zellmenge sowie die ausgeprägte extrazelluläre Matrix von 3D-Zellkulturen verändern sich auch die Anforderungen an einen Viabilitätsassay. 

Ein Problem bei klassischen Zellkulturen stellt die Verwendung zweidimensionaler (2D) Zell-Monolayer auf Glas- oder Kunststoffoberflächen dar, da diese eine natürliche Gewebeumgebung nur unzureichend nachahmen. In diesen Modellen fehlen die Konsistenz eines natürlichen Gewebes, die biochemischen Konzentrationsgradienten, eine extrazelluläre Matrix (ECM) sowie Zell-Zell- bzw. Zell-Extrazellulärmatrix-Interaktionen, die ein natürliches Gewebe definieren. Um diese Limitationen zu überwinden, widmen sich Wissenschaftler mehr und mehr dreidimensionalen (3D) Zellkulturplattformen, wie z.B. dem 3D-Bioprinting.

Das Grundprinzip des magnetischen 3D-Bioprinting ist die Magnetisierung von Zellen, z.B. mit dem NanoShuttle™ Bioprinting Kit, einer biokompatiblen Nanopartikel-Mischung bestehend aus Gold-Nanopartikeln, Eisenoxid und Poly-L-Lysin (PLL).

Anzeige

Über das PLL werden die Bestandteile elektrostatisch an die Zellmembran gebunden.

Bild 1. Die Zellen werden über Nacht mit dem NanoShuttle™-Kit magnetisiert, in Medium resuspendiert und in einer Multiwell-Platte ausgesät. Durch Magnete unter der Multiwellplatte werden die Zellen nach unten zueinander gezogen und aggregieren dadurch innerhalb weniger Stunden zu Sphäroiden. (Bild: Promega)

Dabei haben die Nanopartikel keinen Einfluss auf die Zellviabilität oder Funktion der Zelle und lösen sich nach 7-8 Tagen von dieser. Derart magnetisierte Zellen können anschließend trypsiniert, in Medium resuspendiert und neu ausgesät werden. Durch Magnete unter der Multiwellplatte werden die Zellen nach unten zueinander gezogen und aggregieren dadurch zu einem Sphäroid. Ist die Verbindung einmal hergestellt, beginnen die Zellen größere Strukturen zu formen (Bild 1).

3D-Zellkulturen untersuchen 
Die Untersuchung von Sphäroid-Zellkulturen stellt eine immerwährende Herausforderung dar. 3D-Kulturen haben eine große Zellmasse und extracelluläre Matrizes, wodurch sich fluo-reszenzbasierte Assays zur Untersuchung nur eingeschränkt nutzen lassen. Darüber hinaus können 3D-Zellkulturen empfindlich auf das Hinzufügen oder Entfernen von Flüssigkeiten reagieren. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden zwei lumineszente Zellviabilitäts- Assays, der CellTiter-Glo® sowie der RealTime-Glo™ Assay getestet, um deren Leistungsfähigkeit bei 3D- Zellkulturen zu evaluieren. 

Bild 2: Sphäroiddurchmesser und Viabilität. Sphäroidgröße (A) und Zellviabilität (B), gemessen mit dem CellTiter-Glo® Assay. Die Größe der Sphäroide war reproduzierbar, die Viabilität korrelierte linear mit der Zellzahl (n = 9). (Bild: Promega)

Der CellTiter-Glo® Assay ist ein Endpunkt-Viabilitätsassay, der den ATP-Gehalt metabolisch aktiver Zellen quantifiziert. Die Zellen werden durch das Reagenz lysiert und die Lumineszenz im Medium wird gemessen. Der RealTime-Glo™ Assay ist ein nicht-lytischer Assay, der eine Langzeitmessung der Zellviabilität in Echtzeit ermöglicht. Dafür wird ein zellgängiges Prosubstrat innerhalb lebender Zellen zum NanoLuc® Luciferase-Substrat reduziert. Das NanoLuc®-Substrat diffundiert aus der Zelle ins Medium, wo es durch die Nano- Luc® Luciferase in ein Lichtsignal umgewandelt wird. Die Zellen bleiben am Leben und generieren ein konstantes Lumineszenzsignal für bis zu 72 Stunden. Beide Assays messen die Zellviabilität nach Zugabe nur eines Rea-genzes, wodurch unnötige Pipettierschritte mit den empfindlichen Sphäroid-Kulturen vermieden werden. 

Messung der Zellviabilität 
Für die Zellkultur wurden humane HepG2- sowie PC3-Zellen verwendet. Bei 70-80% Konfluenz wurden NanoShuttle™-Partikel zu den Zellen hinzugegeben (1 µl/10 000 Zellen) und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen magnetisch von der Oberfläche getrennt, gezählt und in Medium resuspendiert. Zeitgleich wurde eine zellabweisende 384-Well-Platte über dem Magnetständer platziert und Zellen wurden in Konzentrationen von 50, 200 und 2000 Zellen/Well (50 µl/Well) ausgesät, wo diese sich sofort zu Sphäroiden zusammenschließen konnten. Die Sphäroide verblieben noch eine Stunde auf dem Magneten, um sich zu festigen. Danach wurde die Platte in den Inkubator gestellt.

Bild 3: Dosisabhängige Antwort von HepG2-Sphäroiden auf Acetoaminophen. Die Viabilität der Sphäroide wurde mit Hilfe des CellTiter-Glo® Assay 72 Stunden nach Zugabe von Acetoaminophen bestimmt. Höhere Konzentrationen hatten einen aussagekräftigen Effekt auf die Zellen (n = 9; p < 0,001). IC50 = 12,76 μM. (Bild: Promega)

Für den CellTiter-Glo® Assay folgte ein Mediumwechsel nach 72 Stunden mit einer 1:1-Mischung aus Medium und CellTiter-Glo®-Reagenz. Der Magnetständer wurde genutzt, um die Sphäroide während der Prozedur unten zu halten und damit die Sphäroid-Integrität zu bewahren. Nach Zugabe des CellTiter-Glo®-Reagenzes wurde die 384-Well-Platte vom Ständer genommen und das Lumineszenzsignal wurde mit Hilfe eines Luminometers gemessen. Weiterhin wurde der Effekt von Acetoaminophen auf die Viabilität untersucht. Unterschiedliche Mengen Acetoaminophen wurden zu den HepG2-Sphäroiden hinzugegeben (2000 Zellen/Sphäroid) und für 72 Stunden inkubiert. Nach 72 Stunden erfolgte die Untersuchung.

Der RealTime-Glo® MT Cell Viability Assay wurde direkt nach Bildung der Sphäroide und Austausch des Mediums in einem 1:1-Verhältnis (Medium zu RealTime-Glo® Reagenz) hinzugegeben. Ein 384-Well-Magnetständer wurde genutzt, um die Sphäroide während der Prozedur unten zu halten und damit die Sphäroid-Struktur zu bewahren. Nach Zugabe des Reagenz wurde die 384-Well-Platte vom Ständer genommen und die Zellen in einem Inkubator kultiviert. Die Lumineszenzmessung mit Hilfe eines Luminometers erfolgte zu definierten Zeitpunkten bis zu einer letzten Messung nach 72 Stunden.

Um die Ergebnisse der CellTiter-Glo® und RealTime-Glo™ Assays zu bestätigen, wurden die Sphäroide nach 72 Stunden zusätzlich jeweils nach Färbung mit zwei für lebende respektive tote Zellen spezifischen fluoreszenten Markern (Calcein-AM und Ethidiumhomodimer-1) im Fluoreszenzmikroskop untersucht.

Bild 4: Echtzeit-Viabilitätsbestimmung von PC3-Sphäroiden verschiedener Größen. Das Wachstum (A) und das Lumineszenzsignal (B) der PC3-Sphäroidkulturen einer Messreihe über 72 Stunden mit dem RealTime-Glo ™ Assay. Alle Sphäroide wuchsen während der 72 Stunden, Sphäroide mit einer Startmenge von 50 Zellen wuchsen am schnellsten (n = 24). (Bild: Promega)

Lumineszente Assays optimal für 3D-Zellkulturen geeignet 
Aus den HepG2-Zellen konnten bei allen Zellkonzentrationen mit Hilfe des magnetischen 3D-Bioprintings Sphäroide von reproduzierbarem Durchmesser erzeugt werden. Die Größe des Magneten, und folglich das damit erzeugte magnetische Feld, ist der Faktor mit entscheidendem Einfluss auf Form und Größe der Sphäroide. Die Ergebnisse mit CellTiter-Glo® zeigen, dass die Viabilität mit der Zellzahl korreliert, was wiederum bedeutet, dass die Zellen in den Sphäroiden lebensfähig sind und dieser Wert auch messbar ist. Gleichzeitig wird demonstriert, dass der CellTiter-Glo® Assay erfolgreich die Viabilität in 3D-Zellkulturen nachweisen kann, eine schwierige Herausforderung für Assays, die von der Diffusion durch eine dichte Struktur abhängen. Diese Ergebnisse wurden durch Lebend-/Tot-Zellfärbung bestätigt (Bild 2).

Um nachzuweisen, dass der Assay die Fähigkeit besitzt, Toxizität in 3D-Zellkulturen nachzuweisen, wurden HepG2-Zellen für 72 Stunden Acetoaminophen ausgesetzt und die Zellviabilität wurde mit Hilfe des CellTiter-Glo® Assays bestimmt. Acetoaminophen hatte signifikante Auswirkungen auf die Viabilität. Frühere Studien zur Viabilität in HepG2-Sphäroiden zeigten einen ähnlichen Effekt (Bild 3).

Bild 5: Lebend-/Totzellfärbung (lebendig = grün, tot = rot.) von PC3-Sphäroiden nach 72 Stunden und Behandlung mit dem RealTime-Glo™ Assay. Sphäroide mit 2000 (links), 200 (Mitte), und 50 (rechts) Zellen zu Beginn sind dargestellt. Es sind kaum tote Zellen zu erkennen. Messbalken = 250 μm. (Bild: Promega)

Als nächstes wurde getestet, ob sich der RealTime-Glo™ Assay zur Bestimmung magnetisch erzeugter PC3-Prostatakrebszell-Sphäroide eignet. Eine Messreihe über 72 Stunden mit dem RealTime-Glo™ Assay belegte ein Wachstum der Sphäroide aller Größen über den kompletten Zeitraum. Das Sphäroidwachstum war umgekehrt proportional zur Zellzahl, wobei Sphäroide mit 50 Zellen um das Achtfache wuchsen. Der Unterschied in der Wachstumsrate kann auf die geringere Größe und den damit verbundenen besseren Zugang zu Nährstoffen der Zellen in der Mitte der 3D-Kultur zurückgeführt werden. Im Lauf von 72 Stunden konnte kein Rückgang des Lumineszenzsignals festgestellt werden, was die Robustheit des RealTime-Glo™ Assays zur Messung der Viabilität in Echtzeit verdeutlicht. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurde der Versuch per Lebend-/Tot-Zellfärbung bestätigt. Dies demonstriert, dass es möglich ist, die Sphäroide nach der Behandlung mit dem RealTime-Glo™ Assay zusätzlich zu färben. Darüber hinaus bestätigt der Versuch, dass die NanoShuttle™-Partikel nicht mit dem Fluoreszenzsignal interferieren (Bild 4, Bild 5).

3D-Bioprinting und lumineszente Assays für das High- Throughput-Screening
Das magnetische 3D-Bioprinting liefert eine einfache und schnelle Methode, um Sphäroide mit einer hohen Reproduzierbarkeit herzustellen. Schwierigkeiten bei der Bestimmung der Zellviabilität in 3D-Zellkulturen, die z.B. durch eine Behinderung des Fluoreszenzsignals durch hohe Zelldichte hervorgerufen werden können, lassen sich durch den Einsatz lumineszenter Assays wie CellTiter-Glo® und RealTime-Glo™ vermeiden. Es wurde gezeigt, dass diese Assays eine geeignete Methode zur Bestimmung der Viabilität in magnetisch erzeugten 3D-Kulturen bieten. Daher bieten die Assays zusammen mit der 3D-Bioprinting-Methode eine ideale Kombination für Hochdurchsatz-Compoundscreenings.

Glauco R. Souza, PhD, Nano3D Bioscience, Houston, Texas, USA
Christian Walczuch, Promega, Mannheim

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige

Proteinsynthese

Gedrängel in der Zelle

Sollen Zellen wachsen und sich erfolgreich vermehren, müssen sie große Mengen an Proteinen bilden. Diese werden von speziellen Zellmaschinen, den Ribosomen, hergestellt. Will man das Wachstum beschleunigen, braucht es also einer Vielzahl solcher...

mehr...

Zellkultureinsätze

Künstliche Haut statt Tierversuche

Mit den Zellkultureinsätzen ThinCert bietet das Unternehmen Greiner Bio-One eine echte Alternative zu Tierversuchen. Denn seit dem 11. Juli 2013 ist es nach der EU-Kosmetikverordnung verboten, Kosmetika, die an Tieren getestet wurden, in den Staaten...

mehr...
Anzeige

Zukunft Zelle

4. Kongress Industrielle Zelltechnik

Die Musik- und Kongresshalle Lübeck wurde am 12. und 13. September zum 4. Mal Anlaufpunkt für Experten und Branchenvertreter der Industriellen Zelltechnik. Etwa 130 Gäste informierten sich dort über die Themen Logistik, Implantate und...

mehr...

Stammzellen-Burger

Greiner Bio-One lieferte Laborartikel

Die Herstellung des ersten Stammzellen-Burgers, der kürzlich weltweit Schlagzeilen machte, gelang auch dank der hochqualitativen Laborprodukte von Greiner Bio-One. Der Technologiepartner für die diagnostische und pharmazeutische Industrie steuerte...

mehr...

Parallele Bioreaktorsysteme

Perfektes Zusammenspiel

Parallele Bioreaktorsysteme Die DASGIP Information and Process Technology GmbH hat Eppendorfs New Brunswick Bioreaktortechnologien in ihre Bioprozesskontrolle integriert. Nach der Übernahme der DASGIP durch die Eppendorf AG im Januar dieses Jahres...

mehr...

PCR-Mycoplasma-Test-Kits PromoKine

Sensitiver Nachweis

Die PromoKine PCR-Mycoplasma-Test-Kits für konventionelle oder auch Real-Time-PCR sind ideal für einen schnellen, hochsensitiven und verlässlichen Nachweis von sämtlichen für die Zellkultur-Kontamination relevanten Mykoplasmen-Arten und gemäß der...

mehr...

Newsletter bestellen

Immer auf dem Laufenden mit dem LABO Newsletter

Aktuelle Unternehmensnachrichten, Produktnews und Innovationen kostenfrei in Ihrer Mailbox.

AGB und Datenschutz gelesen und bestätigt.
Zur Startseite