Dabei kommt für jedes Zielprotein ein eigenes, spezifisches Set an Primärantikörpern, Sekundärantikörpern sowie Anregungs- und Emissionsfiltern zum Einsatz. Die Herausforderungen hierbei liegen sowohl auf der experimentellen Seite als auch am Detektionsgerät selbst (siehe Abbildung 1). Nur um ein paar wenige Beispiele zu nennen: Kreuzreaktionen bei den Antikörpern und überlappende Spektren der verschiedenen Fluorophore müssen vermieden oder reduziert werden, die Qualität der Anregungslichtquelle genauso wie die spektralen Eigenschaften der Emissionsfilter müssen den Anforderungen genügen.

Abb. 1. Schematische Darstellung eines Fluoreszenz-Western Blots.

Bei der für Western Blots am häufigsten verwendeten Nachweismethode kommt ein Chemilumineszenz-Substrat zum Einsatz. Dieses ist sowohl auf der experimentellen Seite als auch für die Detektion einfacher durchzuführen und mit weniger potentiellen Problemen behaftet: Der Sekundärantikörper ist an ein Enzym gekoppelt (entweder Meerrettich-Peroxidase oder Alkalische Phosphatase). Dieses Enzym setzt das zugegebene Substrat um, wobei Licht entsteht, das durch geeignete Messgeräte nachgewiesen und quantifiziert werden kann.

Einzelversuch Cy®3

Es werden keine Filter benötigt, es kann keine Überlappung zwischen den einzelnen Fluorophoren geben. Auch der unspezifische Hintergrund auf der Membran ist leichter in den Griff zu bekommen. Allerdings emittieren alle Substrate mehr oder weniger im gleichen Wellenlängenbereich (etwa 480 nm) – was Multiplex-Methodiken ausschließt. Erfordert also das experimentelle Vorgehen die Detektion zweier oder mehrerer Proteine auf einer einzigen Membran, bleibt nur der Multiplex Fluoreszenz Western Blot.

Die Detektion von Fluorophor-markierten Antikörpern, vor allem als Multiplex Fluoreszenz Western Blot, galt traditionell als Domäne der Laserscanner-Imager. Das hatte seine Gründe in technischen Spezifikationen der Laserscanner wie beispielsweise geringer Streulichtanteil, hohe Anregungsintensität oder ausgeprägte spektrale Reinheit des Anregungslichtes.

Einzelversuch Cy®5

Technische Weiterentwicklungen der letzten Jahre sowohl in der Software als auch in der Hardware machten jedoch die Ergebnisse beim Multiplex Fluoreszenz Western Blot auch bei den CCD-Sensor basierten Geräten immer besser. Abbildung 2 zeigt ein anschauliches und sehr gelungenes Beispiel eines Multiplex Fluoreszenz Western Blots mit den Fluorophoren Cy®3 und Cy®5.

Material und Methoden
Normale Rabbit- und Mouse- Serums wurden 2x verdünnt (Jackson Immuno Research Laboratories) und mit SDS-PAGE (4-12%, Invitrogen™) aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurden auf Nitrocellulose-Membranen übertragen. Die Blots wurden simultan 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Verwendung von Western Breeze® blocking Puffer (Invitrogen™) mit goat-α-rabbit IgG-Cy®3 und goat-α-mouse IgG-Cy®5 inkubiert (1:1.250) und dann mit Sekundärantikörper: 4x5 Minuten in Tris-buffered Saline (TBS mit 0,1% Tween® 20) gewaschen.

Multiplex Western Blot in der Überlagerung

Für die Detektion der Fluorophore wurde der Imager ChemStudio PLUS mit XENON-Lichtquelle eingesetzt. Passende Filtersets für Anregung und Emission wurden für die beiden Fluorophore Cy®3 und Cy®5 gewählt. Die Expositionszeiten am CCD-Imaging-Gerät wurden für maximale Signalamplitude ohne Übersättigung eingestellt und lagen bei etwa 1 bis 5 Sekunden, je nach Filterset. Für die Auswertung der Aufnahmen wurde die VisionWorks®-Software (Analytik Jena/ UVP) eingesetzt: Ein Algorithmus zur Hintergrundreduktion wurde angewendet und der Kontrast eingestellt. Die Cy®3-Aufnahme wurde mit der Falschfarbenfunktion der Software grün, die Cy®5-Aufnahme rot eingefärbt. Mit der Überlagerungsfunktion der Software wurden beide Bilder zu einem einzigen verschmolzen.

Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 2 zeigt
a) Rabbit-IgG detektiert mit Cy®3-markiertem goat-α-rabbit IgG im Einzelversuch

b) Mouse-IgG detektiert mit Cy®5- markiertem goat-α-mouse IgG im Einzelversuch

c) Multiplex Fluoreszenz Western Blot: 2-fach Verdünnung der Mouse und Rabbit Serumproteine detektiert mit Cy®3-markiertem goat-α-rabbit IgG und Cy®5-markiertem goat-α-mouse IgG auf dem gleichen Blot (Expositionszeit: 1 sec).

Abbildung 2c zeigt anschaulich, wie effektiv die jeweiligen Kanäle für die beiden Fluorophore Cy®3 und Cy®5 für die Detektion getrennt werden konnten. Ein Crosstalk zwischen den einzelnen Fluorophoren ist nicht detektierbar, der unspezifische Hintergrund auf der Membran konnte durch viermaliges Waschen sehr niedrig gehalten werden. Trotz der sehr kurzen Belichtungszeiten konnten Signalamplituden erzeugt werden, die die zur Verfügung stehende Dynamik ausreizen. Die Belichtungszeiten in diesem Versuch mit Detektion mittels eines CCD-Sensor basierten Imagers sind mit 1 bis 5 Sekunden sehr kurz.

Die Ergebnisse bestätigen die Eignung von Multiplex Fluoreszenz Imaging mittels CCD-Imager für den gleichzeitigen Nachweis von verschiedenen Proteinen auf Membranen.

Quellen:
Gallagher, S. R. & Wiley, E. A. Current Protocols: Essential Laboratory Techniques. Wiley, 2012

Autoren:
Dr. Martin Auer, Analytik Jena AG, Jena, Germany;
Dr. Sean Gallagher, UVP LLC, Upland, CA;
Abhishek Trikha, BVSc&A.H., M.S. UVP LLC, Upland, CA;
Samet Serdar Yildirim, MSc, PSM, UVP LLC, Upland, CA