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Bild 1: Einfluss exogener Faktoren auf das Metabolom. © Felix Schmauder/Universität Hamburg; Grafik erstellt mit biorender.com

Direct analysis in real time (DART) stellt eine vergleichsweise neue Ionisationstechnik für die Massenspektrometrie (MS) dar. Diese Ionisationsmethode macht das direkte Einbringen und Ionisieren einer Probe oder eines Probenextraktes möglich, ohne vorherige chromatographische Trennung der Analyten. In Verbindung mit einem hochauflösenden Quadrupol-Time-of-Flight (qToF)-Massenanalysator oder einem in der Routineanalytik häufig eingesetztem Triple-Quadrupol (QQQ)-Massenspektrometer ergeben sich mit DART einige inhärente Vorteile.

Bild 2: Arbeitsablauf einer Metabolomanalyse mittels DART-MS. © Universität Hamburg

Für die Extraktion der Metabolite wurde eine Abwandlung der unpolaren "Bligh and Dyer"-Extraktion angewandt. Anschließend wurden die Extrakte mittels einer DART-Quelle ionisiert und mittels eines qToF-Analysators analysiert (Bild 3). Dabei wurden zeitgleich 647 Signale (Features) erfasst. Die Analyse der Massenspektren zeigte hohe Signalintensitäten, insbesondere im Bereich der Triacylglyceride (TG, m/z 800 – 950) und der Diacylglyceride (DG, m/z 550 – 650). Darüber hinaus fanden sich Signale von Monoacylglyceriden (MG) und Fettsäuren (FS) im Bereich von m/z 230 – 350 (m/z = Masse-zu-Ladungsverhältnis).

Bild 3: Die verwendete DART-Ionenquelle mit „DIP-It“-Probenaufgabesystem. © Universität Hamburg

Zur Bewertung der Herkunft der Proben wurde eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt, in welcher die Daten ohne Berücksichtigung der Herkunft nach ihrer Varianz aufgetrennt wurden. Die Analyse der Hauptkomponenten ergab insbesondere in der Darstellung der Hauptkomponente 1 gegen 4 eine Tendenz zur räumlichen Auftrennung der Proben nach ihrer Herkunft (Bild 4A). Dies deutet darauf hin, dass herkunftsrelevante Informationen in den Daten vorhanden sind.

Für eine gezielte Klassifizierung der Proben zur Herkunftsanalyse wurde der Random-Forest-Algorithmus genutzt. Die Analyse wurde durch zehn-fache Kreuzvalidierung mit 100 Wiederholungen verifiziert, was zu einer Genauigkeit von 84,4 % führte (Bild 4B). Die Genauigkeit variierte dabei zwischen 73,7 % für Proben aus der Ukraine und 95,7 % für die Proben aus Peru.

Besonders bei den ungarischen Proben zeigten sich mit 80,1 % eine geringere Genauigkeit und häufig Verwechslungen mit französischen Proben, was auf Ähnlichkeiten im Klima und den geographischen Bedingungen zwischen Ungarn und Frankreich zurückzuführen sein könnte. Bei den Proben aus den USA und Spanien traten ebenfalls einige Fehlklassifizierungen auf, die möglicherweise aus der heterogenen Herkunft der amerikanischen Proben resultierten.

Herkunfts-Marker identifiziert

Um die signifikantesten Verbindungen zur Herkunftsbestimmung zu identifizieren, wurden die Fragmentierungsmuster mittels MS/MS-Experimenten von verschiedenen Standards wie MG, DG und TG analysiert. Die Fragmentierungsmuster dieser Verbindungen zeigten Ähnlichkeiten mit denen, die in der vorangegangen LC-ESI-qToF-MS/(MS)-Analysen beobachtet wurden.

Allerdings unterlagen die Phospholipide, die mittels DART-MS/MS gemessen wurden, einer In-source-Fragmentierung, was die Analyse erschwerte. Insgesamt konnten sieben Marker identifiziert werden, die zur Herkunftsklassifizierung der Proben relevant sind, darunter DG 34:2, DG 34:1, DG 36:3 und DG 36:2 sowie TG 50:1, TG 52:3 und TG 54:5 (angegeben sind hier die Kurzformen der Verbindungsnamen mit Zahl der Kohlenstoffatome:Zahl der Doppelbindungen). Diese Marker, insbesondere aus den Klassen der DG und TG, erwiesen sich als besonders geeignet für die Unterscheidung der Herkunft.

Bild 4: Ergebnisse der Herkunftsbestimmung von Körnermais mittels DART-MS. Abkürzungen für die Herkunftsländer: Esp (Spanien), Fra (Frankreich), Ger (Deutschland), Ung (Ungarn) Per (Peru), Ukr (Ukraine), Usa (USA). A: Scores-Plot der 1. und der 4. Hauptkomponente. B: Konfusionsmatrix (aus Random-Forest-Algorithmus) der gemittelten Testdatensätze zur Darstellung der Vorhersagen des Modells im Vergleich zu den tatsächlichen Klassen. Die Angaben sind in Prozent aufgeführt. Zudem kann der Abbildung die Anzahl der gemessenen Proben (#) entnommen werden. C: Box-Plot der relativen Konzentration eines Triacylglycerids (TG 54:5), welches als geeignete Markerverbindung identifiziert werden konnte. © Elsevier; bearbeitet Felix Schmauder/Universität Hamburg

Besonders bemerkenswert war die Ionisierung der Triacylglyceride in Form von [M+NH4]+- Addukten (M = Molekülmasse), bedingt durch in der Laboratmosphäre vorhandene Ammoniakdämpfe. Die Intensitäten ausgewählter Marker wurden mittels Boxplots (Bild 4C) untersucht, welche verdeutlichen, dass bereits bei einzelnen Markern Unterschiede zwischen den Proben aus verschiedenen Herkunftsländern bestehen. Der Marker DG 36:2 war besonders effektiv, um die Proben aus Peru abzugrenzen, während TG 50:1 und TG 52:3 gute Indikatoren zur Differenzierung zwischen den zentral- und osteuropäischen Ländern boten.

Die Ergebnisse dieser Studie unterstreichen das Potenzial von DART-MS für die Herkunftsbestimmung von Körnermais, indem sie sowohl qualitativ als auch quantitativ wertvolle Informationen zu den Metaboliten liefern. Zudem verdeutlichen die Ergebnisse, dass mittels DART-MS sowohl Konzentrationsunterschiede der einzelnen Marker erfasst werden konnten als auch eine erfolgreiche Klassifizierung durchgeführt werden konnte.

Zusammenfassung und Ausblick

Bereits erfolgreich eingesetzt werden DART-MS-Kopplungen für die Drogen- und Sprengstoffdetektion an Flughäfen, da für diese eine minutenschnelle Analytik für den reibungslosen Ablauf der Sicherheitskontrollen nötig ist. In der Routineanalyse für Lebensmittel sind sie derzeit noch nicht sehr verbreitet.

In diesem Rahmen werden vorrangig LC-ESI-QQQ-Geräte eingesetzt, welche vergleichsweise kostengünstig sowie sensitiv und robust sind. Im Vergleich zu einem qToF-Analysator, welcher in der beschriebenen Studie für die Identifizierung der Markerverbindungen eingesetzt wurde, weisen QQQ-Analysatoren eine deutlich geringere Massenauflösung auf und sind deshalb nicht für die Identifizierung von Markerverbindungen geeignet (qTOF-Massenspektrometer = Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer).

Sind die Analyten allerdings bekannt, eignen sich auch QQQ-Analysatoren für Authentifizierungsexperimente. So könnten die im obigen Beispiel identifizierten Markerverbindungen auf ein LC-ESI-QQQ-MS-Gerät übertragen und validiert werden. Auf diese Weise kann der Transfer von Forschung in die direkte Anwendung sichergestellt werden.

Auch aus diesem Grund arbeiten die Hersteller für Massenspektrometer derzeit an der Entwicklung von DART-QQQ-Kopplungen für die Routineanalytik, um die beschriebenen Vorteile von DART-Ionisierung und QQQ-Analysator auch für die Routineanalytik zugänglich zu machen. Hierdurch könnten sich diese Bauweisen zukünftig in der Routineanalytik für viele Authentifizierungsfragestellungen etablieren, solange eine überschaubare Anzahl von Markerverbindungen für die Klassifikation ausreichend ist.

Ein weiterer Parameter, welcher voraussichtlich die Verbreitung von lösungsmittelfreien Techniken beschleunigen wird, ist das 1,5-Grad-Ziel des Pariser Klimaabkommens. Aufgrund der steigenden CO2-Abgaben und der Verknappung von fossilen Ausgangsprodukten ist eine Preissteigerung für organische Lösemittel erwartbar. Dieser Marktmechanismus begünstigt die Etablierung von lösungsmittelfreien Analysen unter der Voraussetzung, dass die Verfügbarkeit analytischer interner Standards gegeben ist.

Ein weiteres Zukunftsfeld im Rahmen von DART-MS-Applikationen ist die Automatisierung, insbesondere in der Probenvorbereitung. Hier könnten die Kosten für die Analytik durch den Einsatz von Pipettierrobotern weiter reduziert werden, da die Probenvorbereitung derzeit die größte Fehlerquelle der Analytik darstellt und die meiste Zeit in Anspruch nimmt.

Optimal wäre eine Kombination aus einem automatisiertem Pipettierroboter und DART-MS, um einen möglichst hohen sowie reproduzierbaren Probendurchsatz zu gewährleisten. Eine solche Vorgehensweise, die auf einem umweltfreundlichen Messverfahren basiert, könnte die Analytik auf ein neues und nachhaltiges Niveau heben.

Publikationen:
Felix Schmauder, David Schütz, Marina Creydt, Janet Riedl, Markus Fischer: Food authentication goes green: Determination of the geographical origin of grain maize (Zea mays L.) using direct analysis in real time mass spectrometry (DART-MS), Food Control, Volume 163, 2024; https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2024.110489

David Schütz, Elisabeth Achten, Marina Creydt, Janet Riedl, and Markus Fischer: Non-Targeted LC-MS Metabolomics Approach towards an Authentication of the Geographical Origin of Grain Maize (Zea mays L.) Samples, Foods 2021, 10(9), 2160; https://doi.org/ 10.3390/foods10092160

Danksagung:
Die Autoren danken Janet Riedl vom Bundesinstitut für Risikobewertung und David Schütz für die Bereitstellung der Proben.

AUTOREN
Felix Schmauder, Dr. Marina Creydt, Prof. Dr. Markus Fischer
Hamburg School of Food Science – Institut für Lebensmittelchemie
Universität Hamburg
[email protected]
www.chemie.uni-hamburg.de