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Real-time-PCR - Kleinstvolumina im Hochdurchsatz messen

Real-time-PCRKleinstvolumina im Hochdurchsatz messen

Durch Zuhilfenahme eines Pipettier-Roboters und der Standardisierung des Proben-Setups können besonders im 384-Well-Hochdurchsatzformat fundierte und reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden – auch im Kleinstvolumenbereich.

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Real-Time PCR-System

Mit wachsenden Probenaufkommen und neuen molekularbiologischen Untersuchungsoptionen ändern sich die Anforderungen an die quantitative Real-Time-PCR. Der Übergang auf ein Multiwell-Format mit 384 Proben eröffnet hier neue Applikationsfelder in Genexpression, Mutationsanalyse und Diagnostik.

Die Real-time-PCR im Hochdurchsatzformat 384-Well bedarf eines stetig homogenen Auslesens sehr kleiner Probenvolumina, die neben Faktoren wie Geschwindigkeit und experimenteller Genauigkeit im Hochdurchsatz-Format eine immer wichtigere Rolle spielen. Der qTOWER³ 84 der Analytik Jena liefert diese präzise Performance im 384-Well-Hochdurchsatz-Format zum einen durch einen die Temperaturuniformität garantierenden Aluminiumblock. Zum anderen hat das Unternehmen die patentierte Hochleistungsoptik aus der qTOWER³ Produktfamilie auf 16 Fasern erweitert und ermöglicht so eine Auslesezeit von nur sechs Sekunden für eine komplette 384-Well-Platte – unabhängig von der verwendenden Anzahl der Fluoreszenzfarbstoffe.

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Real-time-PCR: Kleinstvolumina im Hochdurchsatz messen

Bei der Durchführung einer Hochdurchsatz-qPCR steigt der Vorbereitungsaufwand. Daneben erfordert das Setup für den Reaktionsansatz der qPCR gewisse Fähigkeiten und Erfahrungen. Neben einer Vervierfachung der Probenzahl vom 96-Well-Standardformat spielt das reduzierte Probenvolumen außerdem eine wichtige Rolle. Diese Kleinstvolumenbereiche müssen stringent präzise pipettiert werden, da selbst sehr kleine Variationen an Ausgangsmaterial zu großen Unterschieden in der Amplifikation führen.

Um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Real-Time PCR-Reaktionen zu standardisieren und zu verbessern, empfiehlt sich der Einsatz eines Pipettier-Roboters. Dies erleichtert alle anstehenden Pipettieraufgaben im Labor enorm und erlaubt die volle Automatisierung von PCR- und Real-time-PCR-Reaktionsansätzen. Die Standardisierung der Abläufe reduziert die Fehler von Reaktionen mit 10- bzw. 5-µl-Ansatzvolumen erheblich – unabhängig von Erfahrung und Geschick des Anwenders. Automatisiertes Reaktions-Setup birgt vielerlei Vorteile: zum Beispiel höchste Präzision sowie die Möglichkeit routinemäßig kleinere Reaktionsvolumen zu bearbeiten, als dies bei manuellen Ansätzen möglich wäre. 

Real-time-PCR: Kleinstvolumina im Hochdurchsatz messen

Anwendungsbeispiel aus der Mikrobiologie
Unter Verwendung extrahierter DNA aus Escherichia coli, eines sequenzspezifischen Primerpaares und dem 2-fach konzentrierten innuMIX qPCR MasterMix SyGreen (Analytik Jena) wird eine E.coli spezifische Targetsequenz von 120 bp in Echtzeit im 384-Well-Format amplifiziert.

In einer Variation des Reaktionsvolumens wurden in fünf technischen Replikaten 5 µl bis 20 µl des PCR-Master-Mixes eingesetzt. Im Anschluss wurde die Spezifität des Amplifikationsproduktes in einer Schmelzkurve überprüft. Die Amplifikation erfolgt in einer FrameStar® qPCR-Platte (4titude) mit einer initialen Denaturierung von 120 s gefolgt von 35 Zyklen mit der Denaturierung bei 95 °C für 15 s, Annealing bei 58 °C für 15 s und Elongation bei 72 °C für 30 s. Das Fluoreszenzsignal wurde in jedem Zyklus bei 72 °C aufgenommen.

Verglichen wurde ein manuelles Reaktionssetup mit der Handpipette mit einem automatisierten Reaktionsansatz, der mit dem Pipettier-Roboter GeneTheatre (Analytik Jena) pipettiert wurde. 

Real-time-PCR: Kleinstvolumina im Hochdurchsatz messen

Zwei Mikroliter sind ausreichend
Die Ergebnisse der Volumenvariation zeigen, dass es für diesen Assay problemlos möglich ist das Reaktionsvolumen auf bis zu 2 µl zu reduzieren. Selbst dieses geringe Probenvolumen zeigt eine Standardabweichung der Ct-Werte von nur ± 0,05 über fünf Replikate.

Der Amplifikationsplot aus dem automatisiert erstellten Reaktions-Setup mit dem Pipettier-Roboter zeigt ebenfalls eine homogene Verteilung der volumenvariierten Real-time-PCR-Kurven. Hier zeigt sich, dass die Standardabweichungen der von der Software kalkulierten Ct-Werte nochmals geringer sind im Vergleich zu den Ct-Werten im Experiment mit der Handpipette. Somit können mit einem Pipettier-Roboter besonders im 384-Well-Hochdurchsatzformat durch Standardisierung des Proben-Setups und der Pipettier-Routine fundierte und reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden – auch im Kleinstvolumenbereich.

Melanie Jahn
Martin Knoll

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