Real-time-PCR

Kleinstvolumina im Hochdurchsatz messen

Durch Zuhilfenahme eines Pipettier-Roboters und der Standardisierung des Proben-Setups können besonders im 384-Well-Hochdurchsatzformat fundierte und reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden – auch im Kleinstvolumenbereich.

Bild 1: qTOWER3 84 Real-Time PCR-System und Pipettier-Roboter GeneTheatre.

Mit wachsenden Probenaufkommen und neuen molekularbiologischen Untersuchungsoptionen ändern sich die Anforderungen an die quantitative Real-Time-PCR. Der Übergang auf ein Multiwell-Format mit 384 Proben eröffnet hier neue Applikationsfelder in Genexpression, Mutationsanalyse und Diagnostik.

Die Real-time-PCR im Hochdurchsatzformat 384-Well bedarf eines stetig homogenen Auslesens sehr kleiner Probenvolumina, die neben Faktoren wie Geschwindigkeit und experimenteller Genauigkeit im Hochdurchsatz-Format eine immer wichtigere Rolle spielen. Der qTOWER³ 84 der Analytik Jena liefert diese präzise Performance im 384-Well-Hochdurchsatz-Format zum einen durch einen die Temperaturuniformität garantierenden Aluminiumblock. Zum anderen hat das Unternehmen die patentierte Hochleistungsoptik aus der qTOWER³ Produktfamilie auf 16 Fasern erweitert und ermöglicht so eine Auslesezeit von nur sechs Sekunden für eine komplette 384-Well-Platte – unabhängig von der verwendenden Anzahl der Fluoreszenzfarbstoffe.

Bild 2a: Darstellung der Amplifikation einer 120 bp E.coli spezifischen Targetsequenz im qTOWER3 84. In der obenstehenden Grafik wurde ein manuelles Reaktions-Setup mit der Handpipette zur Durchführung der Volumenvariation genutzt.

Bei der Durchführung einer Hochdurchsatz-qPCR steigt der Vorbereitungsaufwand. Daneben erfordert das Setup für den Reaktionsansatz der qPCR gewisse Fähigkeiten und Erfahrungen. Neben einer Vervierfachung der Probenzahl vom 96-Well-Standardformat spielt das reduzierte Probenvolumen außerdem eine wichtige Rolle. Diese Kleinstvolumenbereiche müssen stringent präzise pipettiert werden, da selbst sehr kleine Variationen an Ausgangsmaterial zu großen Unterschieden in der Amplifikation führen.

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Um die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Real-Time PCR-Reaktionen zu standardisieren und zu verbessern, empfiehlt sich der Einsatz eines Pipettier-Roboters. Dies erleichtert alle anstehenden Pipettieraufgaben im Labor enorm und erlaubt die volle Automatisierung von PCR- und Real-time-PCR-Reaktionsansätzen. Die Standardisierung der Abläufe reduziert die Fehler von Reaktionen mit 10- bzw. 5-µl-Ansatzvolumen erheblich – unabhängig von Erfahrung und Geschick des Anwenders. Automatisiertes Reaktions-Setup birgt vielerlei Vorteile: zum Beispiel höchste Präzision sowie die Möglichkeit routinemäßig kleinere Reaktionsvolumen zu bearbeiten, als dies bei manuellen Ansätzen möglich wäre. 

Bild 2b: Darstellung der Amplifikation einer 120 bp E.coli spezifischen Targetsequenz im qTOWER3 84. Hier wurde die qPCR mit einem automatisierten Reaktionsansatz, hergestellt mit dem Pipettier-Roboter GeneTheatre, durchgeführt.

Anwendungsbeispiel aus der Mikrobiologie
Unter Verwendung extrahierter DNA aus Escherichia coli, eines sequenzspezifischen Primerpaares und dem 2-fach konzentrierten innuMIX qPCR MasterMix SyGreen (Analytik Jena) wird eine E.coli spezifische Targetsequenz von 120 bp in Echtzeit im 384-Well-Format amplifiziert.

In einer Variation des Reaktionsvolumens wurden in fünf technischen Replikaten 5 µl bis 20 µl des PCR-Master-Mixes eingesetzt. Im Anschluss wurde die Spezifität des Amplifikationsproduktes in einer Schmelzkurve überprüft. Die Amplifikation erfolgt in einer FrameStar® qPCR-Platte (4titude) mit einer initialen Denaturierung von 120 s gefolgt von 35 Zyklen mit der Denaturierung bei 95 °C für 15 s, Annealing bei 58 °C für 15 s und Elongation bei 72 °C für 30 s. Das Fluoreszenzsignal wurde in jedem Zyklus bei 72 °C aufgenommen.

Verglichen wurde ein manuelles Reaktionssetup mit der Handpipette mit einem automatisierten Reaktionsansatz, der mit dem Pipettier-Roboter GeneTheatre (Analytik Jena) pipettiert wurde. 

Bild 3: Vergleich der automatisch generierten Ct-Werte der qPCRsoft im qTOWER3 84.

Zwei Mikroliter sind ausreichend
Die Ergebnisse der Volumenvariation zeigen, dass es für diesen Assay problemlos möglich ist das Reaktionsvolumen auf bis zu 2 µl zu reduzieren. Selbst dieses geringe Probenvolumen zeigt eine Standardabweichung der Ct-Werte von nur ± 0,05 über fünf Replikate.

Der Amplifikationsplot aus dem automatisiert erstellten Reaktions-Setup mit dem Pipettier-Roboter zeigt ebenfalls eine homogene Verteilung der volumenvariierten Real-time-PCR-Kurven. Hier zeigt sich, dass die Standardabweichungen der von der Software kalkulierten Ct-Werte nochmals geringer sind im Vergleich zu den Ct-Werten im Experiment mit der Handpipette. Somit können mit einem Pipettier-Roboter besonders im 384-Well-Hochdurchsatzformat durch Standardisierung des Proben-Setups und der Pipettier-Routine fundierte und reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden – auch im Kleinstvolumenbereich.

Melanie Jahn
Martin Knoll

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