Charakterisierung von Biomolekülen

Direkte Kopplung der nativen Trennmodi HIC und IEX mit MS

Über experimentelle Ergebnisse von Untersuchungen verschiedener Biomoleküle mit Methoden, bei denen die LC-Verfahren IEX (Ionenaustauschchromatographie) bzw. HIC (Hydrophobe Interaktionschromatographie) mit der Massenspektrometrie gekoppelt wurden, berichten die Autoren in diesem Artikel.
Bild 1: Chromatogramm und Massenspektren des NIST MAbs [2]. © YMC; Quelle [2]

Die Massenspektrometrie (MS) ist eine der wichtigsten Methoden in der Analytik von Biomolekülen, da sie nicht nur ein äußerst sensitives Detektionsverfahren ist, sondern auch eine umfassende Charakterisierung von Biomolekülen ermöglicht. Eine Kopplung mit nativen Biochromatographie-Modi wie Ionenaustauschchromatographie (IEX), hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) oder Größenausschlusschromatographie (SEC) ist demnach äußerst wünschenswert. Die direkte Kopplung dieser Methoden mit MS ist jedoch aufgrund der Inkompatibilität nicht-flüchtiger Salze und des Einsatzes hoher Salzkonzentrationen nicht ohne Weiteres möglich. Ein Ansatz, dies zu umgehen, ist die zweidimensionale Flüssigchromatographie (2D-LC). Dabei dient die zweite eingesetzte Dimension als Entsalzungseinheit, so dass die Eluenten MS-kompatibel werden. Die 2D-LC ist jedoch häufig ein zeitintensives Verfahren, erfordert ein spezielles Setup und auch eine spezielle Software. Eine Alternative ist die direkte Kopplung der LC-Verfahren IEX (Ionenaustauschchromatographie) und HIC (Hydrophobe Interaktionschromatographie) mit der MS, die im Folgenden genauer betrachtet werden.

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Kopplung von IEX mit MS

Die IEX ist eine der Standardtechniken für die Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern (MAbs), da bei dieser Trennmethode unter nativen Bedingungen gearbeitet werden kann. Somit bleibt die natürliche Proteinstruktur eines Biomoleküls erhalten, was ideal für große und labile Proteinkomplexe ist. Diese Eigenschaft ist für die Charakterisierung von Biopharmazeutika wie MAbs unabdingbar, da Proteine ihre therapeutische Funktion nur im nativ gefalteten Zustand zeigen. Rekombinante MAbs sind empfindlich gegenüber enzymatischen und chemischen posttranslationalen Modifikationen (PTMs), welche wesentlich zur Ladungsheterogenität von MAbs beitragen. Die Ladungsvarianten werden bereits bei der Herstellung therapeutischer MAbs routinemäßig mit verschiedenen biochemischen Methoden beobachtet, weil manche Ladungen die therapeutische Wirkung beeinflussen können. Für eine therapeutische Anwendung ist es daher essentiell, die PTMs und ihren Einfluss auf die Ladungsheterogenität zu bestimmen.

Die IEX wird standardmäßig dafür genutzt, Proteinladungsvarianten in nicht-denaturierender Weise zu trennen und zu isolieren, um sie im Anschluss daran z. B. per MS zu charakterisieren. Neben der Zeitintensität dieses zweistufigen Prozesses besteht außerdem die Möglichkeit, dass kleinere Biomoleküle, die keine ausgeprägten UV-Peaks aufweisen, übersehen werden. Die direkte Kopplung mit einer sensitiven Detektionsmethode wie der MS ist daher äußerst erstrebenswert. In einer Studie von Yan et al. wird für die direkte Kopplung ein kombinierter pH- und Salzgradient basierend auf einem MS-kompatiblen Puffersystem verwendet. Die Ladungsvarianten verschiedener MAbs können so getrennt werden, bevor eine Online-Detektion mittels MS durchgeführt wird [1]. Hierzu wird die starke Kationenaustauscher-Säule (SCX) BioPro IEX SF (von YMC Europe) mit nicht-porösem Bett verwendet. Nach der Säule wird ein Splitter, der den analytischen Fluss für die anschließende MS-Detektion verringert, eingebaut. Danach erfolgt die Kopplung an eine Nanospray-MS (NSI-MS), welche sich durch eine verbesserte Sensitivität gegenüber normaler ESI-MS auszeichnet und höhere Toleranzen gegenüber Salzkonzentrationen hat. Die Vorteile dieser Kopplungsmethodik können am Beispiel der Charakterisierung des NIST MAbs gezeigt werden. Das Total Ion Chromatogramm (TIC) (Bild 1) zeigt eine gute chromatographische Auflösung für die verschiedenen Ladungsvarianten des NIST MAbs. Darüber hinaus ist in den aufgeschlüsselten Massenspektren von „Main“ und „Acidic 1“ eine detaillierte Bestimmung des ∆mass möglich und damit eine genaue Identifizierung dieser Ladungsvariante.

HIC-MS für die MAb-Charakterisierung

Die direkte Kopplung von MS spielt jedoch nicht nur für den Einsatz der IEX eine entscheidende Rolle, sondern auch für die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC). Typischerweise werden bei der HIC nicht-flüchtige Salze wie beispielsweise Ammoniumsulfat in der mobilen Phase eingesetzt, um den gewünschten Aussalzeffekt zu erreichen. Doch da der Einsatz von nicht-flüchtigen Salzen bei der Kopplung mit MS nicht möglich ist, stellt sich die Frage, wie die LC-Bedingungen angepasst werden können, um HIC-MS zu realisieren.

Bild 2: UV- und MS-Chromatogramm und Massenspektren einer MAb-Mischung [4]. © YMC; Quelle [4]

Yan et al. zeigen, dass auf Ammoniumacetat als MS-kompatiblen Puffer zurückgegriffen werden kann [3]. Gleichwohl muss dieser in einer höheren Konzentration eingesetzt werden, damit der gewünschte Aussalzeffekt erreicht wird. Eine direkte Injektion ist zwar nicht möglich, doch mit folgendem interessanten Setup ist der Einsatz der MS möglich. Zunächst wird die Salzkonzentration verringert, indem ein „Make-up“-Fluss mit Wasser nach der Säule hinzugefügt wird. Dies dient der Verdünnung. Damit einhergehend verdünnt sich auch die Konzentration des Analyts, so dass eine NSI-MS verwendet wird. Die Reduktion der Flussrate erfolgt über einen Splitter. Hier werden drei verschiedene Flusswege generiert: a) Richtung UV-Detektion, b) Richtung MS und c) Richtung Überlauf. Der Fluss, der nun ins NSI-MS eingebracht wird, beträgt nur noch 1 – 5 µl/min. Dies ist ein guter Kompromiss, so dass keine verspätete Elution oder Peakverbreiterung auftritt.

Mit diesem Setup konnten Yan et al. zeigen, dass die Charakterisierung von MAbs und Antibody-Drug-Konjugaten (ADCs) über HIC-MS möglich ist. Vorteilhaft hierbei sind detaillierte Ergebnisse unter nativen Elutionsbedingungen. Im linken Teil von Bild 2 ist der Vergleich zwischen UV-Detektion und MS anhand von sieben verschiedenen MAbs dargestellt. Dabei wird eine BioPro HIC BF Säule (YMC Europe) verwendet unter Einsatz von Ammoniumacetat als Puffer. Die beiden TIC-Diagramme sind vergleichbar, mit dem entscheidenden Vorteil, dass die MS-Detektion wesentlich mehr Informationen ermittelt. Über das aufgelöste Massenspektrum können die MAbs eindeutig identifiziert werden. Nur zwei der untersuchten MAbs konnten nicht aufgelöst werden (MAb 5 und MAb 6), jedoch konnte über das aufgelöste Massenspektrum die chromatographische Trennung von MAb 5 und seiner oxidierten Form gezeigt werden (siehe Bild 2).

Bild 3: Chromatogramm und Massenspektren des SigMAb ADC Mimics [5]. © YMC; Quelle: [5]

Unter Verwendung dieses Setups können monoklonale Antikörper und auch Cystein-verlinkte Antikörper-Drug-Konjugate (ADCs) erfolgreich charakterisiert werden. Als Beispiel dazu dient ein IgG1-Antikörper konjugiert mit Dansylfluorophoren an Cysteingruppen der Disulfidbrücken. In Bild 3 ist die HIC-MS-Analyse des ADC Mimics unter Angabe des Wirkstoff-Antikörper-Verhältnisses (DAR) dargestellt. Das DAR gibt Aufschluss über die Wirksamkeit eines ADCs, so dass eine detaillierte Charakterisierung entscheidend ist. Geringe DAR-Werte reduzieren die Wirksamkeit, während hohe Werte die Pharmakokinetik und Toxizität negativ beeinflussen können. Über die Online-Kopplung von HIC-MS können die verschiedenen DAR-Spezies nicht nur getrennt werden, sondern ihre Masse kann außerdem direkt bestimmt werden (siehe Bild 3). Darüber hinaus können auch kleine Peaks in einem hochaufgelösten Massenspektrum abgebildet werden (s. Peak P2).

Fazit

Die Kopplung der MS mit IEX oder HIC ist eine Bereicherung, da viele entscheidende Vorteile genutzt werden können. Aufgrund ihrer hohen Sensitivität können komplexe Biomoleküle wie MAbs oder ADCs direkt und umfassend charakterisiert werden. Dies ist ohne einen separaten Isolationsschritt möglich. Die Methoden wirken nicht-denaturierend, ergeben eine gute Auflösung und sind einfach in ihrer Anwendung.

Referenzen:
[1] Y. Yan, A. P. Liu, S. Wang, T. J. Daly und N. Li, „Ultrasensitive Characterization of Charge Heterogeneity of Therapeutic Monoclonal Antibodies“, Anal. Chem., 2018, 90, 13013-20.
[2] YMC Co., Ltd., Application Note; „Online native mass SCX-MS analysis of monoclonal antibody“, 2020.
[3] Y. Yan, T. Xing, S. Wang, T. J. Daly, N. Li, „Online coupling of analytical hydrophobic interaction chromatography with native mass spectrometry for the characterization of monoclonal antibodies and related products“, J. Pharm. Biomed. Anal., 2020, 186, 113313.
[4] YMC Co., Ltd., Application Note, „Online native HIC-MS analysis of a monoclonal antibody mixture“, 2020.
[5] YMC Co., Ltd., Application Note, „Online native HIC-MS analysis of cys-linked ADCs“, 2020.

AUTOREN
M.Sc. Julia Sablotny, Dr. Daniel Eßer
YMC Europe GmbH, Dinslaken
Tel.: 02064/427-0
info@ymc.de
www.ymc.de

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