Die Gaschromatographie ist eine der sehr gut etablierten Trenntechniken, die erfolgreiche Entwicklungen hinter sich hat, jedoch noch Potenzial für Weiterentwicklungen erkennen lässt. Wie diese aus Sicht von Anwendern* aussehen sollten, wird anhand einiger Themen dargestellt.

Bilder

Bild 1: Zeitverlauf (oben nach unten) wichtiger GC-Parameter (Temperatur von Ofen und Injektor, Vordruck und Splitfluss; links nach rechts) im Vergleich zwischen dem einfachen Split-Injektor (rot) und dem komplexen „Programmed Temperature Vaporizer“, kurz PTV (schwarz). © Agilent; modifiziert W. Brodacz

Die roten Linien in Bild 1 zeigen, dass bei der Split-Injektion, wie bei jeder GC-Trennung, nur das Temperaturprogramm optimiert werden muss. Die Injektor-Temperatur ("Inlet temperature"), der Säulenvordruck ("Inlet pressure") und das Split-Verhältnis (resultierend aus dem "Split vent flow") werden bei der Methodenentwicklung ausgetestet und bleiben während der gesamten Chromatographie konstant (gerade rote Linien).

Oft wird argumentiert, dass es durch die enormen Fortschritte in der Massenspektrometrie und der großen Steigerung der Sensitivität gerechtfertigt sei, in der Gaschromatographie die Split-Injektion anzuwenden, obwohl dabei wiederum sehr viel Empfindlichkeit (zumindest im Ausmaß des Split-Faktors) verschenkt wird. Wenn hohe Sensitivität gefordert ist, kommt der Anwender um die etwas anspruchsvollere Splitless-Injektionstechnik nicht herum. Diese hat auch den Vorteil, dass sie alternierend mit der Split-Injektion auf sog. Split/Splitless-Injektoren angewendet werden kann, ohne ein Gerät umbauen oder in größerem Maße adaptieren zu müssen. Es ist nur der jeweils geeignete Liner (Verdampfer-Röhrchen aus Glas bzw. Quarzglas) zu tauschen.

Noch mehr Sensitivitätsgewinn verspricht die sog. "Pressure-Pulse Splitless-Injektion". Das ist eine weiterentwickelte Form der Splitless-Injektion, die den kritischen Probentransfer mit einem zeitlich programmierten Druckpuls unterstützt. Unter optimierten Bedingungen können damit größere Probenvolumen in die Trennsäule "gepresst" werden, um die Nachweisstärke zu verbessern. Diese Technik erfordert aber auch zusätzliche Fachkenntnis, um Bandenverbreiterungseffekte und damit Trennleistungseinbußen zu verhindern. Außerdem schränkt sie die Auswahl an geeigneten Lösungsmitteln noch weiter ein.

Die Split-Injektion hat zwar den großen Vorteil, dass sie auch bei matrixreichen Proben lange Zeit ohne größere Probleme verwendet werden kann und die Auswahl des Lösungsmittels wesentlich weniger kritisch ist als bei der Splitless-Injektion. Es besteht aber auch der Verdacht, dass mangelnde Kenntnis, geringer Ausbildungsstand, aber auch schwindendes Wissen durch fehlende Weiterbildung die Hauptursachen dafür sein könnten, dass manche GC-Anwender die scheinbar wesentlich einfachere Split-Technik bevorzugen. Personen, welche die Komplexität der Splitless-Injektion zu meiden suchen, besitzen oft auch nicht die Kenntnisse und die Kritikfähigkeit, um die Fehlerquellen der Split-Injektion richtig einzuschätzen.

Spezielle Methoden erfordern Fachkenntnis und Erfahrung

Bild 2: Moderner PTV-Injektor (Kaltaufgabesystem mit Möglichkeit zur Lösungsmittelausblendung). © Gerstel

Noch wesentlich anspruchsvoller hinsichtlich des Verständnisses und der Optimierungsparameter sind Probenaufgabemethoden wie "Cool On-Column" (COC) und "Programmed Temperature Vaporizer" (PTV) (Bild 2). Diese fortschrittlichsten Injektionstechniken stellen die höchsten Ansprüche an den Anwender und haben den größten Optimierungsbedarf.

Die schwarzen Linien in Bild 1 zeigen, dass im Gegensatz zur Split-Injektion auch die Temperatur des Injektors, der Säulenvordruck und der Gasfluss durch den Injektor ("Split vent flow") sorgfältig optimiert werden müssen. Diese Techniken erfordern präzise Druckprogrammierungen, spezielle Liner, schnelle Heizungen und meist auch ein "Retention Gap" für optimale Leistungsfähigkeit. Diese im Zeitverlauf variierenden Parameter sind sehr stark abhängig von der Art und Menge des injizierten Lösungsmittels und der physikalisch chemischen Eigenschaften der Zielanalyten. Wie in Bild 1 (schwarz) gezeigt, müssen alle vier Verlaufskurven sorgfältig aufeinander abgestimmt werden, um eine gute Quantifizierung sicherzustellen und die Anfangs-Startbanden der Zielanalyten möglichst wenig zu verbreitern.

Das gilt umso mehr für die Königsdisziplin der Injektionstechniken, die "Large Volume Injection" (LVI) mit Lösungsmittelausblendung (Bild 1 schwarz und Bild 3). Darunter versteht man die Injektion großer Volumina (durchaus mehrere 100 µl) bei abgesenkter Injektor-Temperatur und offenem Split-Ventil, um den Großteil des entstehenden Lösungsmitteldampfes aus dem Injektor zu entfernen, ohne die Säule damit zu belasten und ohne dabei Zielanalyten "zu verlieren". Der Einsatz dieser Technik belohnt die Mühe jedoch mit enormen Vorteilen, was die Empfindlichkeitssteigerung und Automatisierung einer Methode anbelangt. Unter optimalen Bedingungen können mehrere Zehnerpotenzen an Sensitivitätsgewinn erzielt werden. Insbesondere der PTV-Injektor kann universell eingesetzt werden und übt (wie COC) im Gegensatz zu schlagartig verdampfenden Methoden (Split/Splitless) den geringsten thermischen Stress auf die Analyten aus.

Bild 3: Innenansicht eines PTV-Liners. Während die Zielsubstanz (blau) im kalten Liner zurückgehalten wird, kommt es zur selektiven Ausblendung des Lösungsmittels (gelb). Abschließend wird der PTV schnell erhitzt und transferiert die Zielanalyten in die GC-Säule. © Agilent

Die deutlich höhere Komplexität in der Anwendung (Bild 1, schwarz) dieser hocheffizienten Injektionstechniken wird auch weiterhin der größte Hemmschuh für die meisten GC-User bleiben. Erfahrene GC-Anwender werden diese "Highly Sophisticated"-Methoden aber zunehmend mehr und erfolgreich für hochentwickelte Applikationen nutzen.

Fast-GC und Low-Pressure-GC-MS

Geschwindigkeitssteigernde GC-Techniken werden als Fast-GC bezeichnet und haben schon vor vielen Jahren versucht, die GC-Welt zu revolutionieren. Das Grundprinzip der Beschleunigung beruht auf der Reduzierung des Innendurchmessers und auch der Länge der Säulen. Die dafür verwendeten Kapillaren werden Microbore-Säulen genannt und haben Innendurchmesser von deutlich unter 0,25 mm. Damit kann eine Verkürzung der chromatographischen Laufzeit zumindest um den Faktor fünf realisiert werden. Abgesehen von den offensichtlichen Vorteilen der wesentlich schnelleren Analytik, erfordern diese Säulen jedoch auch entsprechende Voraussetzungen bei der GC-Hardware. Die erfreulicherweise sehr schmalen und steilen Peaks bedingen hohe Datenakquisitionsraten der Detektoren, was besonders in der Massenspektrometrie herausfordernd ist. Auf der anderen Seite sind die Injektionstechniken meist auf die Split-Injektion mit hohem Split-Faktor eingeschränkt, was einen Großteil der Probe verschwendet. Das ist der erste Grund für die meist verringerte Sensitivität dieser sehr schnellen Applikationen. Beim Umstieg auf Fast-GC wird beim Methodentransfer meist versucht, das Phasenverhältnis möglichst konstant zu halten, um die Temperaturprogramme nicht völlig neu entwickeln zu müssen. Unter diesen Voraussetzungen muss bei kleiner werdendem Säuleninnendurchmesser auch die Filmdicke signifikant reduziert werden, wodurch aber auch die Probenkapazität der Säule stark abnimmt. Um daraus resultierende Überladungseffekte zu vermeiden, dürfte selbst mit ausgefeilteren Techniken gar nicht mehr Probenaliquot injiziert werden, was der zweite Grund für die meist reduzierte Sensitivität dieser beschleunigten Methoden ist. Alle diese Einschränkungen machen letztlich die Verwendung von Split-Injektionen mit hohem Split-Faktor notwendig, da sehr schmale Startbanden nur bei schnellem Probentransfer gewährleistet sind. Der positive Effekt ist, dass durch die resultierenden steilen Peaks ein Teil des Empfindlichkeitsverlustes kompensiert wird.

Der Geschwindigkeitsvorteil der Fast-GC für einen hohen Probendurchsatz ist letztlich nur dann sinnvoll nutzbar, wenn auch die Laborkapazität ausreicht, um entsprechend hohe Probenzahlen bei der Aufarbeitung zu bewältigen. Und nicht zu vergessen, auch die massenhafte Auswertung der schnellen Chromatogramme muss zeitnahe bewerkstelligt werden können, damit die Resultate auch ebenso schnell beim Auftraggeber landen. Die beschleunigte GC ist nur in jenen Fällen zweckmäßig, wo die gaschromatographische Auftrennung tatsächlich der zeitbestimmende Faktor der Gesamtanalyse ist und die Nachweisempfindlichkeit nicht die höchste Priorität besitzt.

Ähnliche Vorteile bietet die sog. Low-Pressure-GC-MS (LPGC-MS, Niederdruck-GC-MS), der sehr gute Zukunftschancen vorausgesagt werden. LPGC-MS ist eine Methode, die das MS-Vakuumsystem in Verbindung mit einer speziell entwickelten Säulenkonfiguration verwendet, um den Druck innerhalb der gesamten Säule zu reduzieren und dadurch den GC-Lauf erheblich zu beschleunigen. Durch die Verwendung einer direkt an das Massenspektrometer angeschlossenen analytischen Säule mit einem Innendurchmesser von 0,53 mm Durchmesser und einem Flow-Restriktor auf der GC-Einlassseite kann ein niedriger Druck in der gesamten analytischen Säule aufrechterhalten werden. Dabei wird zwar die Effizienz zugunsten der höheren Geschwindigkeit ein wenig verringert, aber in vielen Fällen kann das angeschlossene Massenspektrometer die meisten koeluierenden Komponenten differenzieren.

MS-Detektion wird Standard

Mit beständig zunehmender Akzeptanz der Massenspektrometrie bewegt sich die Gaschromatographie immer mehr in Richtung GC-MS und parallel dazu bewegt sich die GC-MS immer mehr in Richtung der hochsensitiven und selektiven GC-MS/MS.

Es gibt eigentlich kaum mehr Substanzen in der GC, die nicht mit dem MS-Detektor gemessen und identifiziert werden können. Daher werden ECD (Elektron Capture Detektor), NPD (thermionischer Stickstoff-Phosphor Detektor), FPD (flammenphotometrischer Detektor), aber auch der FID (Flammenionisationsdetektor) als klassischer Allround-Detektor der GC zunehmend durch die GC-MS ersetzt. Die Hauptmotive für diesen Trend zur Massenspektrometrie sind primär die hohe Sicherheit bei der Identifizierung, aber auch die Gelegenheit, die klassischen Detektoren allesamt durch nur einen flexiblen, massenselektiven Detektor zu ersetzen. Ein weiterer Vorteil der GC-MS ist auch, dass sie in vielen Fällen keine vollständige Auftrennung der Zielanalyten mehr erfordert, da diese spektrometrisch differenziert werden können.

Der Flaschenhals der meisten Applikationen ist und bleibt die Probenvorbereitung und bei komplexen Vielstoffgemischen auch die Datenauswertung. Dem ersten Punkt kann mit automatisierten Aufreinigungssystemen (Cleanup-Automaten) begegnet werden, was in vielen Fällen auch Miniaturisierung bedeutet. Dadurch reduziert sich nicht nur der Chemikalienverbrauch, sondern unmittelbar auch die gesundheitliche Belastung (Lösungsmittel) des Personals sowie die Entsorgungskosten. Im Idealfall kann das Robotik-System der Aufarbeitung gleich online mit dem Autosampler der Gaschromatographie gekoppelt werden.

Mehr Informationen aus Daten gewinnen

Für ein effizientes Datenhandling ist es auch in der Chromatographie an der Zeit, die schon in viele Bereiche vorgedrungene Künstliche Intelligenz (KI) anzuwenden. Damit sollten Chromatographiedatensysteme künftig in der Lage sein, die Integration von Peaks wesentlich zuverlässig auszuführen, selbst wenn die Signale verrauscht sind, die Basislinie wandert und negative Störpeaks (z. B. bei Detektion mit einem ECD etc.) auftreten. Moderne Verfahren wie "Machine Learning" und "Deep Learning" sind äußerst hilfreich, wenn sie durch jede manuelle Korrektur der Peak-Integration dazulernen. Damit sollten zeitraubende Kontrollen zuverlässig obsolet werden.

Auch sollte das Reporting des Datensystems alle notwendigen Informationen für die geforderten Resultate selbständig extrahieren und, auf das Wesentliche konzentriert, präsentieren können. Währenddessen sollte die unvermeidbare Datenflut im Hintergrund automatisch so strukturiert archiviert werden, dass eine umfassende Dokumentation nach allen Erfordernissen der Qualitätssicherung gewährleistet ist und im Bedarfsfall relevante Rohdaten schnell reproduziert werden können.

Ziel muss es sein, dass Daten automatisch zu Informationen komprimiert werden und daraus dann Wissen entsteht.

*Anmerkung: Die vorliegenden Ausführungen beruhen auf Recherchen bzgl. Erfahrungen von Anwendern und Meinungen, Statements, Interviews u. Ä. von GC-Experten. Zusammengefasst und mit der Erfahrung von fast 40 Jahren Chromatographie interpretiert, spiegeln die Einschätzungen auch die Ansicht des Autors wider. (Zukunftsgerichtete Aussagen meinen wahrscheinliche bzw. voraussichtliche Entwicklungen.)

AUTOR
Wolfgang Brodacz