Der HPLC-Tipp

HPLC - Was kleine Unterschiede bewirken können

Autor Dr. Stavros Kromidas beleuchtet, welchen Einfluss kleine Unterschiede bei Temperatur, Einstellparametern oder für die Auswertung gewählten Integrationsalgorithmen auf Chromatogramme haben können.

Lassen Sie sich uns jetzt im Sommer traditionsgemäß mit kleinen Tipps beschäftigen. Als erstes, passend zur Jahreszeit, zwei bis drei Bemerkungen zur Temperatur. Alsdann folgen zwei Beispiele, die zeigen, dass man bei Unkenntnis der Einstellparameter einer übernommenen Methode und Verwendung von anderen Zahlenwerten evtl. keine übereinstimmenden Ergebnisse erhält. Das kann viele Nerven bei Methodentransfers bedeuten. Es lohnt sich, gegenüber solchen Dingen ein wenig Sensibilität zu entwickeln.

Bild 1: Unterschiedliche Chromatogramme bei gleicher Temperaturanzeige und zwei unterschiedlichen Säulenöfen. Details s. Text. © Michael Heidorn / ThermoScientific

Temperatur

  • Wir unterstellen, dass zwei Säulenöfen technisch in Ordnung sind; sie wurden vor kurzem qualifiziert. Bei gleicher Temperaturanzeige kann es dennoch zu unterschiedlichen Chromatogrammen kommen, wenn das Funktionsprinzip der zwei Öfen unterschiedlich ist (Differenz in der Wärmeabfuhr). Bild 1 zeigt ein Beispiel, das Michael Heidorn, Thermo Fisher Scientific, freundlicherweise zur Verfügung gestellt hat: Bei Verwendung eines Ruhluftofens bzw. eines Luftofens mit aktiver Luftumwälzung kann es sein, dass die Trennung an einer Stelle besser und an anderer Stelle schlechter wird. Sogar Elutionsumkehr ist denkbar.
  • Früh morgens stellen Sie bei Ihrem DAD eine unruhige, wellenförmige Basislinie fest. Ab ca. 10 Uhr sieht sie wesentlich besser aus. Mögliche Erklärung: Morgens ist es noch kalt, die Klimaanlage pustet „ordentlich“ und mancher DAD reagiert bekanntlich empfindlich auf einen Luftzug. Ab ca. 10 Uhr ist das Labor voll mit Menschen, es wird wärmer, die Luftzufuhr durch die Klimaanlage ist geringer, die Basislinie ist zufriedenstellend. Aber auch das Umgekehrte kann passieren: Nachmittags scheint die Sonne ins Labor, die Klimaanlage arbeitet stärker, und …
  • Sie haben auf einmal immer wieder periodisch ein Problem mit der Basislinie oder/und mit einer Verschiebung der Retentionszeit. Früher gab es keine Probleme, weder mit dieser Anlage noch mit dieser Methode. Folgendes war bei einem ähnlichem Fall die Ursache: Vor kurzem wurde in der Nähe der HPLC-Anlage eine Kapillar-GC-Anlage aufgestellt und nach jeder ca. halben Stunde erreichte die HPLC eine „Hitzewelle“.
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Bild 2: Unterschiedliche Integration sowie Basislinie je nach eingestellten Parametern. Details s. Text. © Dr. Stavros Kromidas

Andere Einstellparameter, anderer Integrationsalgorithmus

  • Oft ist es so, dass in Methodenbeschreibungen die Einstellparameter („Settings“) fehlen. Man verwendet somit die voreingestellten Zahlenwerte, die häufig zufällig/willkürlich gewählt wurden. Bild 2 zeigt ein Chromatogramm bei unterschiedlichen Einstellparametern: Es wird anders integriert, auch die Basislinienmarkierung ist unterschiedlich.
Bild 3: UHPLC-Chromatogramm, Auswertung über Empower (ApexTrack). Details s. Text.
  • Bei modernen Auswerteprogrammen hat man die Möglichkeit, nach unterschiedlichen Integrationsalgorithmen auszuwerten. In den Bildern 3 und 4 wird eine UHPLC-Trennung gezeigt; als Software wurde Empower verwendet. Im Falle einer Auswertung über „ApexTrack“ (eher geeignet für kleine, tailende, nicht aufgelöste Peaks) erscheinen im Report 8 Peaks (s. Bild 3). Im Falle von „Traditional“ (eher geeignet für gut aufgelöste Peaks) erscheinen dagegen 13 Peaks, darüber hinaus werden Peaks auf „Buckel“/Drift unterschiedlich integriert.
Bild 4: Gleiche Trennung wie in Bild 3, Auswertung über Empower (Traditional), Details s. Text.

Fazit

Der HPLC-Alltag zeigt immer wieder, dass sich Ergebnisse – oft aufgrund von kleinen, unscheinbaren und nicht beachteten Unterschieden – nicht stets vergleichen lassen.

AUTOR
Dr. Stavros Kromidas

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