Der HPLC-Tipp im Mai

Der Probengeber als Ursache für mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche


Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Im letzten Monat haben wir uns über Probleme betreffend den Detektor unterhalten. Heute wollen wir uns anschauen, welche typischen Autosampler-Probleme zu einer schlechten Reproduzierbarkeit und/oder falschen Peakfläche führen können.

Die Lösung

Einige Probleme beeinträchtigen typischerweise die Reproduzierbarkeit der Injektion, d.h. der Vk ist beispielsweise bei einer 6-fachen Injektion aus einem Vial nicht zufriedenstellend. Hier wäre als Ursache eine zu schnelle Ansauggeschwindigkeit ("Aspiration Rate" oder "Aspiration Time") im Falle von viskosen Probenlösungen zu nennen. Merke: Auch Wasser/ Puffer als Probenlösung ist recht viskos! Andere Ursachen wiederum führen zu einer falschen Peakfläche. Die irreversible Adsorption an der Nadel wäre ein Beispiel dafür: Die meisten Injektionsnadeln bestehen aus Stahl, der relativ hydrophob ist. Eine Physisorption, hervorgerufen durch Adhäsionskräfte, führt nicht nur bei Proteinen zu fehlerhaften Peakflächen, ein Memory-Effekt dort wird auch bei kleinen Molekülen beobachtet. Abhilfe schafft hier der Austausch der Injektionsnadel gegen eine aus einem anderen Material, z.B. Keramik oder Messing - auch eine Ummantelung mit PEEK könnte das Problem lindern. Die meisten Probleme jedoch betreffen leider beides, Präzision und Richtigkeit, also Vk und Peakfläche. Nachfolgend möchte ich stichwortartig einige typische Probleme auflisten.

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 Beim erstmaligen Stechen der Nadel durch das Septum kann im Falle von dicht verschlossenen Vials ein Vakuum entstehen, die Probenlösung wird in die Kanüle gedrückt, diese erste Injektion ist fehlerhaft. Bei den Folgenden ist alles okay, da nun ein Druckausgleich möglich ist.

 In der Spritze befindet sich eine Luftblase, auch manches andere kann sich dort sammeln…

 An der Glasoberfläche der Vials (anderer Hersteller, andere Charge, braune Farbe, eine Fett- oder sonstige Schicht an der Oberfläche, etc.) erfolgt eine teilweise Sorption des Analyten. Geisterpeaks, hervorgerufen z.B. durch Diffusion von Na-Ionen aus dem Glas und eventuelle Reaktion mit dem Analyten, lassen wir hier außer Acht, konzentrieren wir uns auf die Peaks selbst.

 Der Dichtungssitz ist defekt, die Höhe der eintauchenden Nadel variiert. Oder aber jener wurde letztens vom Service-Ingenieur ersetzt und das Material ist nun etwas anders. In diesem Fall erscheinen ähnlich wie weiter oben erwähnt „nur“ Geisterpeaks.

 Das Rack sitzt nicht richtig, die Temperatur ist im Falle eines gekühlten Autosamplers nicht am gesamten Rack konstant. Apropos Temperatur: Sie bzw. eine Änderung dergleichen ist für manch ein Problem verantwortlich:

– Entstehung von Kondenswasser.

– Die Probe selbst oder das Lösungsmittel kann verdampfen, dadurch ändert sich die Konzentration im Vial, verwandt dazu: Entmischung im Vial. Durch den Temperatur- und damit den Dichtegradienten im Vial bzw. die Entmischung/Schlierenbildung ergeben sich – je nachdem, zu welchem Zeitpunkt injiziert wird oder wie tief die Nadel eintaucht, – unterschiedliche Werte. Denke in diesem Zusammenhang an eine eventuelle Temperaturdifferenz zwischen SST/Standardlösung und Proben (Aufbewahrung im Kühlschrank, Proben kommen von außerhalb, sie befanden sich etwas länger an einem sonnigen Plätzchen im Labor, usw.).

 Memory-Effekt am Septum.

 Der Lichtsensor gerät durch direkte Sonneneinstrahlung oder durch Diffusionslicht wegen Aluminiumkappen etwas durcheinander: Das Vial wird nicht gefunden, es wird das falsche gefunden oder der Autosampler bleibt einfach stehen.

 Es liegt ein Problem mit der Waschflüssigkeit vor, z.B. nicht geeignet oder kontaminiert oder aber der Überlauf funktioniert wegen eines Siphoneffekts nicht.

 Mechanische Probleme wie ein Defekt am Arm oder am Greiffinger oder durch von den Vials abgefallene Etiketten seien hier nur kurz erwähnt.

Das Fazit

Die Injektion von Eluent vor dem Start einer jeden Messserie offenbart mögliche Kontaminationen an der Nadel sowie eventuelle Leckprobleme. Die Injektion einer bekannten realen Probe (keine SST-Lösung, die nur den/die Analyten enthält) zeigt, ob alles an diesem Gerät inklusive Autosampler für diese Applikation okay ist.

© by Stavros Kromidas

http://www.kromidas.de

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