Anwenderwissen Chromatographie

Die HPLC-Säule zwischen Unikat und Verbrauchsmaterial

Trennsäulen schonen, schützen, lagern – Der Autor erläutert den richtigen Umgang mit HPLC-Säulen und zeigt auch, wann eine HPLC-Säule eher als Verbrauchsmaterial einkalkuliert werden sollte.

Bild 1: Querschnitt von einer sog. „SecurityGuard™ ULTRA“-Vorsäule (verwendbar bis 1378 bar) mit Funktionsdarstellung. © Phenomenex Inc.

Trennsäulen sind das Herz jeder Chromatographie und entsprechend schonend sollte man mit ihnen umgehen. Dies gilt umso mehr für teure Hochleistungssäulen mit Partikelgrößen unter 2 µm („sub-2 Micron“). Manchmal ist es aber ökonomischer, sie als Verbrauchsmaterial zu betrachten.

Eine gute HPLC-Säule und erst recht eine gute UHPLC-Trennsäule haben ihren Preis. Nicht nur aus wirtschaftlichen Gründen, sondern auch zur Minimierung von analytischen Ausfallzeiten, deren Kosten eine Säulen-Neubeschaffung bei weitem übertreffen können, sind vermeidbare Belastungen von Trennsäulen weitgehend zu reduzieren. Das gilt in erster Linie für die Einhaltung der Vorgaben des Herstellers hinsichtlich der Anwendungsgrenzen. Wer den erlaubten pH-Bereich einer Phase (die meisten Silica-basierenden Phasen sind zwischen pH 2 – 8 stabil) grob verletzt, wird meist bald teuer dafür bezahlen müssen. Das Gleiche gilt für die Höchsttemperatur, obwohl höhere Temperaturen wegen ihres positiven Einflusses auf die Eluentenviskosität gerne zur Reduzierung des Gegendrucks empfohlen werden.

Bei der Belastung durch „Dreck“ in der Probe kann die Rechnung schon wieder etwas anders aussehen. Zuallererst ist es notwendig, die Säule vor unnötiger Partikelbelastung durch unlösliche oder z. B. durch Temperatursprünge der Messlösung ausgefallene Probenbestandteile zu schützen. Eine Filtration der Messlösung mit Membran-spritzenfiltern (0,2 µm) ist in solchen Fällen – und insbesondere bei „Dilute and Shoot“ notwendig bzw. bei UHPLC unverzichtbar.

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Ist ein Clean-up sehr aufwendig und damit kostspielig, kann es unter Umständen wirtschaftlicher sein, darauf zu verzichten („Dilute and Shoot“) und öfter in eine neue LC-Säule zu investieren. Mit dem Einsatz einer Vorsäule gibt es aber – im wahrsten Sinne des Wortes – noch etwas „dazwischen“.

Schutz mit Vorsäulen

Zum Schutz der teuren analytischen Säule sind sog. Vor-, Schutz- bzw. Guard-Säulen ausdrücklich zu empfehlen. Sie enthalten meist ein leicht austauschbares, 2 – 5 mm kurzes Säulenstück, das passgenau im Vorsäulenhalter integriert wird. Die Gesamtkonstruktion wird nahezu totvolumenfrei an die Hauptsäule gekoppelt, so dass es zu keiner Beeinträchtigung der Trennung kommt. Neue Versionen sind auch für die hohen Drücke und die besonderen Anforderungen bezüglich Totvolumenfreiheit der UHPLC geeignet (Bild 1). Für den austauschbaren Trennsäulenteil (s. Materialkammer in Bild 1 und Einwegkartusche in Bild 2) stehen verschiedenste Phasentypen zur Verfügung, um eine gute Anpassung an die analytische Säule zu gewährleisten. (Hinweis: Die hier exemplarisch gezeigte Guard-Säule ist nur eine der von mehreren Herstellern angebotenen Vorsäulen.) Für die Chromatographie von Proben mit geringem Vorreinigungsaufwand ist eine Vorsäule zum Schutz der analytischen Säule sehr empfehlenswert, für den so genannten „Dilute & Shoot“-Ansatz ohne Clean-up absolut notwendig.

Bild 2: Frontansichten von austauschbaren Einwegkartuschen (SecurityGuard™: verwendbar bis 240 bar) mit akkumulierten Ablagerungen (Mitte) im Vergleich zum Neuzustand (unten). © Brodacz

Ohne Schutzsäule würden sich Ablagerungen, grobe Verunreinigungen, schwer lösliche Bestandteile, ausfallende Rückstände und Partikel etc. rasch am Säulenkopf anreichern und den Rückdruck stark erhöhen. Bei der Injektion von Proben in einem anderen Lösungsmittel als dem Laufmittel kann es bei der Vermischung am Säulenanfang durch Polaritätsänderungen zum Ausfallen von Probenbestandteilen kommen. Solche Ablagerungen und Substanzen, die mit der stationären Phase irreversible Bindungen eingehen, können mit einer Vorsäule oft gut genug zurückgehalten werden, um die Standzeit der teuren analytischen Säule wesentlich zu verbessern. Dabei steigt natürlich auch der Systemdruck entsprechend dem Ausmaß der Blockaden an. Ab einem gewissen Druck-Schwellenwert ist es notwendig, die akkumulierten Rückstände (s. hierzu Beispiele in der Mitte von Bild 2) durch Austausch der Einwegkartusche einfach und rasch zu entfernen.

In Bild 3 wird mit einem beschleunigten Lebensdauertest demonstriert, dass eine analytische Trennsäule mittels Vorsäule durch einen einfachen Austausch der Einwegkartusche rasch wieder auf das ursprüngliche Leistungsniveau gebracht werden kann (unten). Ohne Vorsäule (s. Bild 3, oben) verliert eine identische LC-Säule hingegen rascher an Trennleistung (früher und stärker steigende Peakbreiten) und muss in diesem Belastungstest nach ca. 100 „Dilute and Shoot“-Einspritzungen ersetzt werden.

Bild 3: Beschleunigter Lebensdauertest für HPLC-Säulen mit (unten) und ohne (oben) Vorsäule durch wiederholte Injektion von substituierter Milch (300 : 1 verdünnt). Der Anstieg der Peakbreiten der gespikten Pharmazeutika (Peak Width: blau und orange) und der zunehmende Gegendruck (Pressure: grün) verdeutlichen den Leistungsverfall der Trennsäulen. Der Vergleich zeigt die Verlängerung der Standzeit der HPLC-Säule durch die Vorsäule (unten). Mit dem Austausch der Einwegkartusche ist der Druckanstieg reversibel, und die ursprüngliche Leistung kann wieder erreicht werden (unten rechts). © Ulrike Jegle/Agilent Technologies

Bei sub-2-Micron-Packungen ist die Gefahr von Blockaden naturgemäß deutlich verschärft. Das Problem bei der gefürchteten Verstopfung von diesen Hochleistungssäulen sind in erster Linie nicht die extrem feinen Partikel, sondern die notwendigerweise noch viel engeren Fritten. Eine 1,8 µm-Säule enthält ja nicht nur 1,8 µm-Partikel, sondern durch die unvermeidliche Streuung bei der Herstellung ergibt sich eine gewisse Größenverteilung. Während am oberen Ende z. B. Partikel bis 2,2 µm dabei sind, können am unteren Ende auch 1,4 µm-Teilchen auftauchen, die von den vorgesehenen Fritten natürlich sicher zurückgehalten werden müssen. Und selbst solche Fritten unterliegen einer gewissen Porengrößenstreuung, so dass die Säulenhersteller auch diesen „Sicherheitsabstand“ nach unten berücksichtigen müssen. Deshalb statten sie sub-2-Micron-Säulen oft mit Fritten von 0,3 – 0,5 µm Porengröße aus. Eine teilweise Blockade der Eingangs­fritte macht sich primär durch ansteigenden Systemdruck bemerkbar; manchmal kann auch die Peakform (Verbreiterung bzw. Splitting) einen Hinweis darauf geben.

Rückspülen – die „Schubumkehr“ in der LC

Die Hersteller von LC-Säulen wenden beim Packen der Trennsäulen einen wesentlich höheren Druck an, als dem maximal erlaubten Betriebsdruck entspricht. Nur dadurch wird ein sehr dicht gepacktes und gleichmäßiges Partikel-Bett erzielt. Aus diesem Grund ist es auch grundsätzlich möglich, viele LC-Säulen in beiden Richtungen zu verwenden (für Säulenschaltungen ist es oft sogar notwendig, eine Trennsäule in beiden Richtungen betreiben zu können). Damit besteht die Chance, eine teilweise blockierte Säule durch Umkehr der Fließrichtung wieder zu regenerieren. Wie für die chemische Trennung gilt auch hier der Grundsatz: Unpolare Rückstände werden durch unpolare Lösungsmittel gelöst und polare durch polare Laufmittel. Bei einem Gradienten von polar bis unpolar deckt man somit alles ab.

Durch die Rückspülung einer Trennsäule ergeben sich auch folgende Vorteile: Es kommt zur Lockerung unlöslicher Partikel, welche die Eingangsfritte verstopfen. Der Rücktransport und letztlich das Ausspülen von extrem retardierten Störstoffen über den Säulenkopf ist wesentlich schonender, als sie mit „Gewalt“ über die gesamte Säule auszutreiben.

Nur wenn sich der Hersteller bei der Eingangsfritte für eine höhere Porosität entschieden hat, darf eine solche Säule keinesfalls rückgespült werden. Sonst könnten kleine Partikel aus dem Anfangsteil der Säule austreten. Das Konzept mit einer größeren Eingangsfritte (z. B. 2 µm statt 0,3 µm) und einer feineren Endfritte hat in der Praxis aber auch seine Vorzüge. Die größere Fritte ist toleranter gegenüber sehr kleinen Probenpartikeln, und es
dauert wesentlich länger, bis die Säule, besser gesagt die Eingangsfritte, völlig blockiert ist. Bei Säulen, die nur in eine Richtung betrieben werden dürfen, ist es üblich, dass der Hersteller eine gut erkennbare Pfeilmarkierung für die vorgeschriebene Flussrichtung anbringt.

Inline-Filter

Bild 4: Inline-Filter mit einer Porengröße von 0,3 µm für die UHPLC und die totvolumenarme Halterung (max. 1,3 µl) im Größenvergleich. © Wolfgang Brodacz

Einen besonderen Schutz vor Partikeln brauchen sub-2 Micron-Säulen wegen ihrer sehr feinen Säulenpackung (z. B. 1,7 µm) und ihrer noch viel engeren Fritten. Die LC-Hersteller haben daher spezielle, sehr feine, sog. Inline-Filter entwickelt, die meist zwischen Autosampler und Vorsäule positioniert werden. Bei der Konstruktion dieser winzigen Fritten und insbesondere deren Halterung muss besonders auf die Vermeidung von Totvolumen und eine einfache Handhabung geachtet werden (Bild 4), denn um ihren regelmäßigen Austausch durch den Anwender sicherzustellen, müssen sie leicht wechselbar sein.

Lagerung von HPLC-Säulen

Für eine kurzfristige Lagerung ist es kein Problem, das Laufmittel in der Säule stehen zu lassen. Bei sehr empfindlichen Säulen kann man auch mit einem sehr niedrigen Fluss (z. B. 0,01 ml/min) weiter spülen. Das hat auch den Vorteil, dass sich keine Schwebeteilchen absetzen können und die Pumpenventile in Bewegung bleiben. Bei Verwendung eines pufferhaltigen Eluenten sollte die Säule jedoch mit Wasser pufferfrei gespült werden, wenn sie über mehrere Tage nicht verwendet werden soll. Dies ist notwendig, um ein eventuelles mikrobielles Wachstum, das vom Puffer meist gefördert wird, wesentlich zu reduzieren. Bei der Lagerung über deutlich längere Zeiträume ist es unbedingt notwendig, den Puffer mit Wasser auszuspülen und die Säule anschließend in einem Gemisch aus organischem Lösungsmittel (z. B. Acetonitril oder Methanol) und weniger als 50 % Wasser zu lagern. In solchen Fällen empfiehlt es sich, auf das Laufmittelgemisch zurückzugreifen, das der Hersteller bei der Auslieferung verwendet hat. Ein direktes Ausspülen des Puffers aus der Säule mit diesem Laufmittelgemisch ist nicht zweckmäßig, da die Gefahr besteht, dass die Puffersalze (insbesondere bei einem höheren Salzgehalt) durch den hohen organischen Anteil in der Säule ausfallen. Solche Rückstände können meist nicht mehr vollständig in Lösung gebracht werden.

LC-Säule als Verbrauchsmaterial

Auch wenn das Hauptaugenmerk auf den Schutz und die Verlängerung der Nutzungsdauer der HPLC-Säule gelegt werden soll, so muss doch auch abgewogen werden, inwieweit sich ein zusätzlicher Aufwand zur Verlängerung der Lebensdauer überhaupt rechnet. Der größte, wenn auch erfolgversprechendste Zusatzaufwand besteht wohl in der Entwicklung spezieller und meist sehr aufwändiger Clean-up-Verfahren. Diese können aber nur dann auch ökonomisch sinnvoll sein, wenn sie für das Erzielen einer bestimmten Selektivität des Gesamtverfahrens ohnehin erforderlich sind. Das trifft meist zu, wo klassische, optische LC-Detektoren dominieren.

Kommen hingegen hochselektive, massenspektrometrische Detektoren zum Einsatz, dann ist eine teure Probenaufreinigung oft entbehrlich. In Fällen, wo das Clean-up hauptsächlich der Lebensdauerverlängerung der HPLC-Säule dienen würde, sollte die Trennsäule unbedingt als Verbrauchsmaterial in die Gesamtkalkulation einbezogen werden.

Geht man davon aus, dass eine neue HPLC-Säule ungefähr 500 € kostet und sie zumindest 500 sog. „Dilute and Shoot“-Injektionen schadlos übersteht, ergibt sich ein Säulenanteil von 1 € pro Probe. Nimmt man weiter an, dass eine durchschnittliche Probe 50 € kosten soll, dann entspricht das 2 % der Materialkosten. In vielen Fällen hält die Säule doppelt oder sogar viermal so lange, was ihren Kostenanteil noch einmal deutlich reduziert.

Eine einfache Kostenabschätzung relativiert auch sehr schnell die vermeintliche Rentabilität von aufwendigen „Wiederbelebungsversuchen“ gealterter Trennsäulen, die – nebenbei bemerkt – oft nicht viel bringen. Kommen dann noch aufwendige, durch Regulatorien erzwungene Überprüfungen der neu gewonnenen Leis­tungsfähigkeit dazu, ist ein Neukauf mit Verweis auf das mitgelieferte Test-Zertifikat des Herstellers oft die ökonomischste Problemlösung.

AUTOR
Wolfgang Brodacz
AGES Lebensmittelsicherheit -
Kontaminantenanalytik, Linz

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