Aspekte einer Methodenoptimierung für die Wasseranalytik

TFA und DFA mit LC-MS/MS bestimmen

Zwecks Optimierung einer LC-MS/MS-Methode zur Untersuchung von Wasser auf TFA und DFA wurden Proben von Leitungs-, Mineral- und Oberflächenwasser untersucht. Die Autoren betrachten Aspekte der Methodenentwicklung.

Trifluoressigsäure (TFA) und Difluoressigsäure (DFA) gehören zu der zurzeit stark im Fokus stehenden Gruppe der Per- und polyfluorierten Alkylsubstanzen (PFAS). Sowohl TFA als auch DFA wurden weltweit in Salz- und Süßgewässern nachgewiesen. Dort liegen sie in ihrer deprotonierten Form vor und sind sowohl sehr mobil als auch äußerst stabil. TFA gelangt durch zahlreiche Eintragswege in die aquatische Umwelt, dazu zählen neben natürlichen auch industrielle Quellen. TFA entsteht des Weiteren durch Transformationsprozesse aus einer großen Zahl Substanzen, die eine CF3-Gruppe enthalten. Das können u. a. Pestizide, Pharmazeutika oder Kühlmittel sein. Im Gegensatz zu TFA ist wenig über die Herkunft von DFA in der Umwelt bekannt. Trotzdem gibt es verschiedene Berichte, in denen DFA in Umweltproben nachgewiesen wurde, weswegen die entwickelte Methode auch für diese Substanz optimiert wurde.

Bild 1: Methodenoptimierung. A: Einfluss der Pufferkonzentration im Eluenten auf TFA und DFA (200ng/l dotiert in Oberflächenwasser); B: Einfluss des pH-Wertes des Eluenten auf die Retentionszeit; C: Abhängigkeit von Retentionszeit, Injektionsvolumen und pH-Wert der Probe. © Waters

Das Umweltbundesamt (UBA) hat im Mai 2020 einen toxikologisch begründeten Trinkwasserleitwert (LWTW) von 60 µg/l, für den nicht in der Trinkwasserverordnung geregelten Parameter TFA, abgeleitet. Bei einer lebenslangen täglichen Aufnahmemenge von TFA in dieser Konzentration sind demnach keine gesundheitlichen Schäden zu erwarten. Allerdings spricht sich das UBA trotz des LWTW dafür aus, eine TFA-Konzentration von 10 µg/l oder niedriger im Trinkwasser anzustreben, um die Trinkwasserqualität nach dem Minimierungsprinzip zu sichern.

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Bild 2: Abschätzung der Nachweisgrenze in Reinstwasser: Quantifier- und Qualifier-Übergang von DFA mit einer Dotierung von 500ng/l und TFA mit einer Dotierung von 10ng/l. © Waters

Die Methodenentwicklung zur Analyse von TFA und DFA erscheint auf den ersten Blick nicht kompliziert, wird aber zu einer Herausforderung, wenn man sich von Reinstwasser, das mit TFA oder DFA versetzt wurde, entfernt und reale Wasserproben betrachtet. Aus diesem Grund wurden zwecks Optimierung einer LC-MS/MS-Methode Proben von Leitungs-, Mineral- und Oberflächenwasser untersucht. Durch das ubiquitäre Vorkommen von TFA und DFA wird die Analytik auch durch Blindwerte erschwert. Im Folgenden werden wir auf die einzelnen Schwerpunkte und Herausforderungen, die bei der Methodenentwicklung relevant waren, eingehen.

Auswählen der analytischen Säule

TFA und DFA sind aufgrund ihrer Struktur sehr polar. Deswegen finden sich in der Literatur Methoden, in denen Ionenchromatographie oder HILIC verwendet werden, um eine Retention zu erzielen. Für unsere Methodenentwicklung konnten wir auf Vorarbeiten aus der Methodenoptimierung für PFAS-Verbindungen ab C4-Kettenlänge zurückgreifen. Dabei wurde eine neuartige sog. Mixed-mode-Säule, die unter Umkehrphasen (RP)-Bedingungen verwendet werden kann, genutzt. Die Säule „Atlantis Premier BEH C18 AX“ unterscheidet sich von anderen C18-gebundenen Umkehrphasensäulen durch zusätzliche positive Ladungen auf der Oberfläche der stationären Phase. Neben der hydrophoben Wechselwirkung ermöglicht diese Oberflächenladung den Anionenaustausch (AX) als einen weiteren Interaktionsmechanismus, um Selektivität und Retention zu optimieren. Die deprotonierten Carboxyl-Gruppen von TFA und DFA wechselwirken mit den positiven Ladungen der stationären Phase der Säule. Diese Retention ermöglicht das Abtrennen von störenden Matrixbestandteilen, die sonst zu Ionensuppression bei der MS-Detektion oder zu Deformation des chromatographischen Peaks führen können.

Die verwendete Säule hat ein Säulengehäuse mit einer speziellen Oberfläche, wodurch sich die Trennung und Detektion von Analyten, die mit Metallen interagieren, verbessert. Die reduzierten Wechselwirkungen mit Metallionen der Säuleninnenfläche können höhere Peakflächen und Empfindlichkeit, weniger Peak-Tailing sowie geringeres Carry-over der Analyten bewirken. Im Folgenden werden Untersuchungen beschrieben, mit dem Ziel, die LC-MS/MS-Bedingungen für die TFA- und DFA-Analytik zu optimieren.

Mobile Phase

Wie eingangs bereits erwähnt, zeigen sich die eigentlichen Herausforderungen bei der Bestimmung von TFA und DFA erst mit der Injektion der realen Proben. Deshalb ist es wichtig, den Trennmechanismus der eingesetzten Säule zu verstehen und die Faktoren, die die Wechselwirkung zwischen dem Analyten und der stationären Phase beeinflussen, zu analysieren. Dabei spielen vor allem die Pufferkonzentration und der pH-Wert eine wesentliche Rolle.

Bild 3: Quantifizierung von TFA in weichem Trinkwasser mittels Standardkonzentration unter Verwendung des internen Standards TFA-13C2. © Waters

Betrachten wir zunächst den Puffer. In Bild 1A ist der Einfluss der Ammoniumacetat-Konzentration im Eluenten am Beispiel von Oberflächenwasser dargestellt. Dabei zeigt sich eine Abnahme der Retentionszeiten und niedrigere Peakflächen bei steigender Pufferkonzentration. Dies ist durch das Verdrängen der negativen Zielverbindungen durch die negativen Acetat-Ionen bei Erhöhung der Pufferkonzentration zu erklären. Im Fall von TFA tritt zusätzlich im Oberflächenwasser eine Suppression durch Matrixinterferenzen auf, die durch ein Abfallen der Basislinie zu erkennen ist und die ebenfalls stark von der Pufferkonzentration abhängt.

Der zweite Parameter, der die Optimierung der LC-MS/MS-Methode beeinflusst, ist der pH-Wert. Dieser hat bei ionisierbaren Molekülen einen signifikanten Effekt auf die Retention. Ein Absenken des pH-Wertes führt bei Verbindungen mit Carboxylgruppe dazu, dass diese weniger stark deprotoniert vorliegen und somit zu einer Abnahme der Retention durch Ionenaustausch. Allerdings liegen die pKa-Werte von TFA und DFA unter 2, so dass die mobile Phase nicht sauer genug ist, um die negative Ladung der Analyte zu verringern. Deswegen verstärkt sich die Retention mit Zugabe selbst geringer Mengen an Ameisensäure, und die Retentionszeiten vor allem von TFA erhöhen sich signifikant (Bild 1B).

Wegen der geringen Zahl an Analyten wurde mit der hier verwendeten Säule isokratisch gearbeitet. Für die Optimierung der Methode wurde getestet, ob ein organischer Anteil in der gepufferten mobilen Phase zu einer Verbesserung der Performance beiträgt. Auch für diesen Parameter war es wichtig, die Realproben zu betrachten, da – im Gegensatz zu Proben auf Reinstwasserbasis – in Oberflächenwasser die Peakfläche von TFA mit Erhöhung des Organikanteils abnimmt.

Injektionsvolumen und Retentionszeit

Obwohl der Trinkwasserleitwert LWTW für TFA auf 60 µg/l festgelegt wurde, haben wir bei der Entwicklung der LC-MS/MS-Methode mittels Direktinjektion eine Bestimmungsgrenze von 20 ng/l angestrebt, um die in Realproben auftretenden Gehalte exakt bestimmen zu können. Für die folgenden Untersuchungen wurde das UPLC-System „ACQUITY UPLCTM I-Class“ gekoppelt an das Massenspektrometer „XevoTM TQ-XS“ eingesetzt. Wie bereits bei den vorangegangenen Methodenparametern beschrieben, spielt auch beim Injektionsvolumen die Matrix eine entscheidende Rolle – interessanterweise weniger in Bezug auf die Peakform, wie vielleicht zu erwarten wäre, als vielmehr auf die Retentionszeit. Diese variiert stärker zwischen verschiedenen Wässern bei höherem Injektionsvolumen und zeigt eine Abhängigkeit vom pH-Wert der Proben. Dieser Effekt und die Korrelation zum pH-Wert ist in Bild 1C dargestellt.

Bild 4: Mit der beschriebenen LC-MS/MS-Methode ermittelte TFA- und DFA-Gehalte in verschiedenen Wasserproben. © Waters

Um die Diskrepanz der Retentionszeiten zwischen verschiedenen Proben zu minimieren, wurden zwei Ansätze getestet. Der erste bestand darin, die Vermischung von mobiler Phase und Probe zu erhöhen. Dazu wurde vor der Säule ein zusätzliches Tubing eingebaut, um künstlich das Bandenverbreiterungsvolumen zu vergrößern. Für den zweiten Ansatz wurde die Probe vor der Injektion mit Puffer und Ameisensäure versetzt, so dass sie identisch zur mobilen Phase vorlag. Beide Maßnahmen ergaben leichte Verbesserungen, was den Angleich der Retentionszeiten zwischen Proben mit unterschiedlichen pH-Werten betrifft. Allerdings verbreitern sich die Peaks beim ersten Ansatz, und der Aufwand für den zweiten Ansatz wird durch das Ergebnis nicht gerechtfertigt. Deswegen wurden die zwischen der Probe mit dem niedrigsten und der Probe mit dem höchsten pH-Wert um ca. 0,5 min variierenden Retentionszeiten akzeptiert. Um die Stabilität der Retentionszeiten zu bestimmen, wurden 200 Folgeinjektionen von weichem Trinkwasser gemessen. Die prozentuale Standardabweichung für sowohl TFA als auch DFA lag dabei unter 0,9 %.

Aus den oben beschriebenen Gründen geht hervor, wie wichtig das Einbeziehen von verschiedenen Realproben (Mineral-, Trink-, Oberflächen- und Grundwasser) ist, um die optimalen Bedingungen für die LC-MS/MS-Methode zu finden. Die finalen Kenngrößen der Methode sind in der Tabelle gelistet (s. Anlage am Ende dieses Artikels).

Massenspektrometrische Detektion

Bei beiden Analyten handelt es sich um kleine Moleküle, die mit ESI (Elektrospray-Ionisation) negativ ionisiert werden. Die Fragmentionen von TFA und DFA sind kleiner als m/z 100, wobei dies im Fall von DFA sogar für das Vorläuferion zutrifft. Bei beiden Verbindungen kommt hinzu, dass kein zweites Fragmention für die Identifizierung zur Verfügung steht. Deswegen wurde ein sog. Pseudo-MRM-Übergang von Vorläuferion auf Vorläuferion mit niedriger Kollisionsenergie zusätzlich aufgenommen, wobei das Grundrauschen der MRM-Spur sehr hoch ist (MRM = Multiple Reaction Monitoring). Im Fall von TFA hat auch der Quantifier-Übergang eine Basislinienhöhe von 1 x 105 AUC. Nichtsdestotrotz wird die angestrebte Bestimmungsgrenze von 20 ng/l für beide Übergänge von TFA erreicht. Bei DFA erreicht die Methode auf dem Quantifier ebenfalls 20 ng/l, wobei allerdings im Qualifier-Übergang erst ab einer Konzentration von 500 ng/l ein Peak sichtbar wird (Bild 2).

Bild 5: Beispiel-Chromatogramme der Quantifier-Spur von TFA und DFA sowie der internen Standards in verschiedenen Wasserproben. © Waters

Die Quantifizierung der Proben erfolgte über zwei Methoden: zum einen die externe Kalibrierung in Reinstwasser und zum anderen die Standardaddition. Die externe Kalibrierung wurde zwischen 10 und 25 000 ng/l aufgenommen, um einen möglichst großen Konzentrationsbereich für die unbekannten Gehalte in den Realproben abzudecken. Das Bestimmtheitsmaß der linearen Regression betrug bei beiden Verbindungen > 0,999, wobei das Verhältnis aus Ist- und Sollwert der zehn Standardlevel unter 15 % lag. Ein Beispiel für die Verwendung der Standardaddition ist in Bild 3 wiedergegeben. Dabei wurde der Gehalt von TFA in einer Trinkwasserprobe durch Aufstockung mit drei Konzentrationsniveaus und Berechnung (im Auswertetool „TargetLynx“) auf 263 ng/l bestimmt.

Wie eingangs erwähnt ist es bei der Analyse von TFA und DFA wichtig, Kontaminationen, die Blindwerte generieren können, zu vermeiden. Daher wurden alle Pipettenspitzen, Vials und Lösungsmittel, die eingesetzt wurden, zuvor getestet.

Analysenergebnisse

Für die Entwicklung der Methode wurden verschiedene Wasserproben aus Großbritannien sowie drei Proben aus Deutschland, die vom Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung – UFZ zur Verfügung gestellt wurden, verwendet. Bild 4 zeigt die ermittelten Gehalte aller Proben und auch die Herkunftsorte der britischen Proben. Die mittels Standardaddition berechneten Konzentrationen waren mit denen mittels externer Kalibrierung erhaltenen vergleichbar.

Bild 5 zeigt Beispiele für Chromatogramme der verschiedenen Wasserproben. Darin ist auch zu sehen, dass die Verwendung von isotopenmarkierten (13C2) internen Standards zur Korrektur der Matrixeffekte insbesondere bei DFA sinnvoll ist. Vergleicht man die Peakintensität des internen Standards in Reinstwasser mit denen der Realproben, ist eine Signalsuppression bis zu Faktor 5 zu erkennen, so dass für die Quantifizierung eine Korrektur des Response-Wertes notwendig ist.

Fazit

Um eine Methode für die Wasseranalytik zu entwickeln und zu optimieren, ist es wichtig, reale Wasserproben, z. B. Wässer aus der Umwelt oder einem Trinkwasserreservoir, zu untersuchen, da die Analysenergebnisse durch Einflüsse weiterer Komponenten in Realproben anders aussehen können als bei gezielt dotierten Proben auf Basis von Reinstwasser. Die hier durchgeführten Analysen zeigten auch, dass in fast allen Realproben TFA und in geringerem Maße DFA zu finden war. Dies unterstreicht die Bedeutung, die Gehalte beider Verbindungen in unserer Umwelt und Trinkwasserversorgung zu bestimmen und zu überwachen.

AUTOREN
Hannah Willmer
Waters Corporation, Wilmslow, GB-Cheshire

Dr. Claudia Rathmann, Dr. Gunnar Weibchen
Waters GmbH, Eschborn
Tel.: 06196/400-600
deutschland@waters.com
www.waters.com

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Tabelle: Experimentelle BedingungenExperimentelle Bedingungen für die Untersuchungen der Wasserproben mit der hier beschriebenen LC-MS/MS-Methode. Quelle: Waters

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