HPLC-Tipp

Sinnvolle Säulentests abhängig von der Zielsetzung

Der Fall
Die wenigsten Anwender führen Säulentests durch – wenn doch, dann wird oft die Bodenzahl ermittelt, man interessiert sich für die Frage: „Ist die Säule noch „gut“?“. Die Mehrzahl führt eher einen Systemeignungstest (SST) durch, in diesem Fall ist die Säule ein Teil des „Gesamtsystems“. Dennoch kommen oft Fragen bzw. Zweifel auf, in etwa: „Reicht das, was wir machen?“ oder: „Wann ist die Säule nicht mehr zu gebrauchen?“ Mit diesen Fragen wollen wir uns heute beschäftigen.

Die Lösung
Säulentests können Informationen zu folgenden Attributen einer HPLC-Säule liefern:
1. Trennleistung (Sprich: Packungsqualität)
2. Eigenschaften der stationären Phase
3. Selektivität/Eignung für ein Trennproblem
4. Stabilität.

Zu 2. und 3. gibt es wenig zu sagen, deswegen können wir diese zwei Punkte schnell „abhaken“:

Eigenschaften stationärer Phasen: wissenschaftlich toll, Praxis-Relevanz eher nein
Seit ca. Anfang der 1980er Jahre sind mehrere Tests vorgestellt worden, um eine stationäre Phase zu charakterisieren – von sehr einfachen bis zu sehr strengen: Es geht dabei z.B. um Silanophilie, um „Shape Selectivity“ bis hin zu Metallionen-Aktivität. Richtige Normierung vorausgesetzt sowie gebührende Sorgfalt bei der Durchführung unterstellt, gelangt man tatsächlich zu sehr interessanten Säulen-Informationen – und das war´s dann auch aus Anwendersicht, denn: Ob man aus diesen Ergebnissen Rückschlüsse zur Eignung der Säule für das eigene Trennproblem erhält, ist fraglich. Das führt uns zum nächsten Punkt:

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Selektivität/Eignung der Säule? Substanz-spezifisch, wichtig und somit notwendig
Es liegt auf der Hand, dass dies eine individuelle Frage und nur mithilfe eines SST zu beantworten ist: „Erfüllt das System – inkl. Säule – die Kriterien unseres SST?“ Wenn ja, ist die Säule für diese Analyte genügend selektiv und somit geeignet. Nicht mehr aber auch nicht weniger. Kommen wir jetzt zu den anderen zwei Tests:

Trennleistung (Effizienz, Maß dafür: Bodenzahl, N)
Die Trennleistung ist ein Maß für die Bandenverbreiterung (Peakverbreiterung) in einem chromatographischen System. Je kleiner die Diffusion der Substanzbande auf dem Weg vom Injektor bis zum Detektor (Apparatur inkl. Säule), umso schärfer die Peaks, umso größer die Bodenzahl. Die resultierende Bodenzahl hängt allerdings von vielen Faktoren ab, so u.a.: Vom Analyten (Toluol oder Pyridin injiziert?), von den chromatographischen Bedingungen (z.B. Injektionsvolumen und Temperatur), vom Totvolumen der Apparatur (z.B. Kapillar-Innendurchmesser und Zellvolumen), von der Geometrie von Fittings und Mischventilen, von den Einstellparametern (z.B. Zeitkonstante und Datenaufnahmerate), von der Partikelgröße und nicht zuletzt von der Packungsqualität der Säule. Merke: Es gibt nicht die Bodenzahl, jene Zahl ist abhängig von den chromatographischen Bedingungen, die ich gewählt habe, um sie zu ermitteln. So kann man mit einfachen Tricks eine fantastische Bodenzahl herzaubern: Viel Acetonitril im Eluenten, etwas erhöhte Temperatur (geringe Viskosität…), kleiner Fluss, Injektion von 1 µl Toluol – und schon bekomme ich eine „gute“ Bodenzahl.

Dr. Stavros Kromidas

Merke aber auch Folgendes: Die resultierende Bodenzahl kann trotz einer hervorragend gepackten Säule aufgrund eines nicht richtig sitzenden Fittings oder einer eingestellten Zeitkonstante von 1 s (für früh eluierende Peaks viel zu groß!) sehr klein sein. Ergibt sich beispielsweise an einer Apparatur unter völlig(!) identischen Bedingungen und mit einem unproblematischen Analyten wie Toluol gegenüber einer früheren Messung eine kleinere Bodenzahl, ist dies ein Hinweis auf eine Verminderung der Packungsqualität. Umgekehrt weiß ich, dass wenn die Bodenzahl von Toluol (oder eines anderen einfachen Aromaten wie Anthracen oder Biphenyl) in etwa konstant bleibt, die Säule nach wie vor „gut“ gepackt ist. Ob jedoch die Säule weiterhin beispielsweise meine zwei Amine gut trennen kann, weiß ich nicht, denn: Aufgrund einer falschen Lagerung der Säule kann die Anzahl der Silanolgruppen zugenommen haben, dadurch kann die Peakform der Amine akut schlechter geworden sein, die geforderte Auflösung wird nicht erreicht – die Säule zeigt aber weiterhin die geforderte und weiterhin gute Bodenzahl mit Toluol.

Fazit: Die Bodenzahl kann – sofern sämtliche Messbedingungen konstant bleiben – als objektives Maß für die Packungsqualität dienen. Diese Information ist jedoch von geringer Bedeutung. Verwende ich als Kriterium für die Güte meiner Trennung die Auflösung (Abstand zwischen den interessierenden Peaks an der Peakbasis) kann ich auf die Bodenzahl als Kriterium verzichten, denn sie ist indirekt in der Auflösung enthalten.

Säulenstabilität
Die Überprüfung der Säulenstabilität in einem frühen Stadium ist für eine Routinemethode eminent. Dieser Test wäre aus meiner Sicht in einem solchen Fall immer durchzuführen, denn so erhalte ich wenigstens einen Hinweis, ob die vorgesehene Säule unter den aktuellen Bedingungen voraussichtlich viele Injektionen wird aushalten können.

Durchführung: Man bestückt den Autosampler mit realen Proben und lässt diese bei den üblichen Bedingungen von Freitag bis Montag injizieren. Am Montag wird der SST erneut durchgeführt und man vergleicht nun das Ergebnis mit dem von Freitag. Wichtig: Es ist nicht sinnvoll, die Säulenstabilität dadurch überprüfen zu wollen, in dem lediglich Eluent im Kreislauf laufen gelassen wird – dass Säulenhersteller dies gerne tun, „geschenkt“... Das Injizieren ist schon notwendig, um zu testen, wie die Säule auch mit dem Druckstoß, der bei jeder Injektion erfolgt, fertig wird.

Das Fazit
Säulencharakterisierung ist aus wissenschaftlicher Sicht interessant, für den Anwendungs-orientierten HPLC-Menschen vermutlich weniger – er will ja „seine“ Analyten trennen, und ein Silanophilie-Ranking beispielsweise dürfte ihn eher weniger interessieren.

Ein nach vernünftigen Kriterien durchgeführter Systemeignungstest (SST) mit realen Proben ist der mit Abstand beste Test: Ich erfahre, ob hier und jetzt an dieser Apparatur die Trennung nach vorgegebenen Kriterien funktioniert oder nicht.

Bodenzahl: Überspitzt formuliert, ein Relikt von vorgestern: Zahlen mit „Anderen“ zu vergleichen, um etwas über die Packungsqualität sagen zu können, ist kaum möglich, da die Anderen (Kunden, Partnerlabor in …, Säulenhersteller, Literatur, etc.) eher unwahrscheinlich 100 % die gleichen Rahmenbedingungen haben wie ich – was aber eine Grundvoraussetzung wäre.

Und was sagt eigentlich in einem Hersteller-Prospekt eine Bodenzahl von 400 000 Böden/m aus, wenn ich die Säule für eine ganz andere Applikation nutzen will? Es sei denn, ich muss mehr als ca. 50…70 sehr ähnliche Substanzen trennen.

In diesem Fall kommt die Peakkapazität (Anzahl Peaks pro Zeiteinheit) ins Spiel und damit die Peakbreite und somit die Bodenzahl. Eine Säule mit großer Bodenzahl hilft mir in diesem Fall ungeheuer.

Säulenstabilität: Im Falle einer vorgesehenen Routinemethode sollte man das besagte Wochenende schon investieren:

Die je nach Länge des Laufs getätigten 150…200 Injektionen geben mir immerhin ein Gefühl für die Säulenstabilität unter realen Bedingungen – also eine sinnvolle Sache.

©by Stavros Kromidas
http://www.kromidas.de

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