Triple-Quad versus hochauflösende MS/MS

Techniken der Tandem-Massenspektrometrie

Triple-Quadrupol-Massenspektrometer gelten (noch) als der Goldstandard für spurenanalytische Applikationen. Die Entwicklungsfortschritte bei der hochauflösenden Tandem-MS stellen diese dominierende Rolle immer mehr in Frage. Eine Gegenüberstellung der Vor- und Nachteile beider Techniken soll deren Möglichkeiten und Limitierung aufzeigen.

Vergleicht man Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (QQQ bzw. QqQ), welche als die Arbeitspferde der quantitativen organischen Spurenanalytik gelten, mit der hochauflösenden Tandem-MS (Q-HRMS), so ist der herausragendste Vorteil der Q-HRMS die wesentlich höhere Massenauflösung in der zweiten MS-Stufe. QQQ-Konfigurationen werden für typische Quantifizierungsaufgaben fast ausschließlich im MRM-Modus (Multiple Reaction Monitoring) mit zwei Produkt-Ionen aus einem Precursor eingesetzt. Tandemsysteme wie Q-TOF (QqTOF) bzw. Q-Orbitrap nutzen hingegen den technischen Vorteil der Hochauflösung im MS-2 für HR-Komplettspektren.

Unabhängig davon, ob die Time-of-Flight-Technik (TOF) oder die Orbitrap-Technologie zur Anwendung kommt, beide bieten zusätzlich zur Quantifizierung beste Voraussetzungen für sog. Non-Target-Applikationen und bei der Aufnahme von Full-Scan-Daten vor allem auch retrospektives Analysieren der Rohdaten.

Für eine Beurteilung, welche Technologie am besten zu den eigenen Anforderungen und Zielsetzungen passt, sind aber eine Reihe von Aspekten zu beachten. Die folgende Übersicht beruht primär auf einer praxisnahen Arbeit [1] von Anton Kaufmann (Kantonales Labor Zürich CH) u. Phil Teale (LGC UK) sowie ergänzend angeführter Fachliteratur.

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Selektivität als oberstes Ziel

Die Selektivität von HRMS-Systemen wird primär vom physikalischen Massenauflösungsvermögen der Hardware dominiert und dann in zweiter Linie vom verwendeten Massenfenster (Mass-Extraction-Window MEW) (Bild 3) bestimmt, das in der Software frei einstellbar ist. Je größer die Massenauflösung der Hardware ist, umso enger kann das Massenextraktionsfenster gewählt werden. Mit zunehmender Einschränkung des MEW steigt die Selektivität der Analytik. Die Größe des Massenfensters muss aber mit Bedacht gewählt werden, denn bei zu starker Einengung kann schon bei geringfügigen Störungen bei der Datenaufnahme oder durch Verunreinigungen, welche sehr ähnliche Massen aufweisen wie der Zielanalyt, das analytische Signal des Zielanalyten völlig abhandenkommen.

Bild 1: Bestimmung des Centroids: Berechnung des Zentrums des Massen-Peaks. © Agilent Technologies

Bei der Bestimmung des hochauflösenden Massenwertes wird üblicherweise der sog. Centroid des Massenpeaks verwendet, d. h. das Peakzentrum wird über die Peakflächen ermittelt (Bild 1). Bei einer koeluierenden Verunreinigung, die eine sehr ähnliche exakte Masse aufweist, aber durch die Auflösung des MS physikalisch nicht völlig von der Masse des Zielanalyten abgetrennt werden kann, kommt es vor, dass dieser Apex, d. h. die Spitze des unaufgelösten Massenpeaks, etwas verschoben wird. Das Ausmaß der Verschiebung des Massen-Centroids (Bild 2, rot) ist von der Massendifferenz der unaufgelösten Signale abhängig und wird mit zunehmender Intensität der Interferenzmasse (violett) größer.

Bild 2: Verschiebung des Massen-Centroids (rot gegenüber schwarz) durch nicht aufgelöstes Störsignal (violett) in Abhängigkeit vom Intensitäts­verhältnis. © Agilent Technologies

Unabhängig davon, ob diese Verschiebung bei der Datenakquisition oder bei der Datenbearbeitung stattfindet, kann schon ein geringer Shift bei zu engem Massenfenster zu einem Verlust des als exakt erwarteten Massensignals führen. Manchmal lässt sich dieser Effekt dadurch erkennen, dass anstelle des erwarteten chromatographischen Peaks ein stark zerklüfteter Signalverlauf auftritt, der gerade noch an einen zerstörten Peak erinnert. Einerseits ist die Einengung des Massenfensters wünschenswert, um die Selektivität zu erhöhen, andererseits ist es wichtig, das Massenfenster auch ausreichend groß zu wählen, um durch die o. g. Verschiebungseffekte keine Analyt-Signale zu „verlieren“. Je breiter das MEW angesetzt wird, umso mehr Empfindlichkeit kann auch gewonnen werden (Bild 3).

Als Hilfestellungen zur Lösung dieses Zielkonfliktes wurden einige Richtlinien erarbeitet, die für eine angemessene Breite des Massenfensters sorgen sollen [2, 3, 4]. Üblicherweise werden Massenfenster von 5 ppm verwendet. Das Thema wird etwas kontrovers diskutiert, weil das optimale MEW von folgenden Faktoren abhängig ist: exakten Massen des Analyten (bekannt) sowie den beobachteten Interferenzen (meist unbekannt), der physikalischen Auflösung des MS und der Art und Weise, wie das Massenspektrometer und das Datensystem die Rohdaten akquirieren und prozessieren. Diese grundsätzlichen Unterschiede beeinflussen letztlich die erzielbare Selektivität und die diagnostische Leistungsfähigkeit.

Schon deshalb ist es nicht so einfach, die hochauflösenden Techniken auf Basis der Selektivität mit klassischen Quadrupol-Tandemmassenspektrometern mit nomineller Auflösung zu vergleichen. Und auch bei den Triple-Quadrupolen hängt die Selektivität eines SRM-Überganges (Selected Reaction Monitoring) sehr stark davon ab, wie diagnostisch der jeweils gewählte SRM für diesen Analyten in der aktuellen Matrix tatsächlich wirkt. Die Abspaltung von Wasser z. B. ist typischerweise ungeeignet.

Hohe Sensitivität und präzise Quantifizierung

Die hochauflösenden Massenspektrometer der ersten Serien (TOF) konnten hinsichtlich Sensitivität, Stabilität der Massenachsen-Kalibrierung, dynamischem Bereich und vor allem Linearität nicht mit den schon etablierten Triple-Quadrupolen konkurrieren und wurden deshalb auch nicht für Quantifizierungszwecke eingesetzt. Doch die rasante Entwicklung der HRMS hat diese anfänglichen Nachteile relativ rasch ausmerzen können und Geräte hervorgebracht, die einen wesentlich höheren dynamischen Bereich abdecken und dabei auch gute Linearität zeigen. Für einen seriösen Vergleich der erzielbaren Sensitivität zwischen QQQ und Q-HRMS ist es verständlicherweise erforderlich, immer nur Geräte zu vergleichen, die dem letzten Entwicklungsstand entsprechen, da die technologischen Fortschritte bei beiden Kategorien sehr groß sein können.

Da es für den Begriff Sensitivität eine Reihe von durchaus differierenden Definitionen gibt, soll sich die weitere Betrachtung auf die erwünschte Fähigkeit eines Massenspektrometers beschränken, wie gut es sehr kleine Mengen eines bestimmten Analyten in einer komplexen Matrixmischung detektieren und bestimmen kann.

Triple-Quadrupol-Instrumente im SRM-Modus gelten derzeit noch immer als die sensitivste Möglichkeit Spurenkomponenten in komplexer Matrix sicher zu quantifizieren. Die Sensitivität und Massenachsenstabilität der Q-HRMS hat sich aber in der Zwischenzeit so stark verbessert, dass sie nun ebenfalls für einen Großteil der Rückstands-Applikationen verwendet werden kann. Letztlich ist es auch stark von der Applikation abhängig, welche Technologie einen systembedingten Vorzug besser nutzen kann oder einen Nachteil kompensieren muss.

Als wichtige Entscheidungshilfe kann z. B. auch die Notwendigkeit für schnelles Polarity Switching dienen. Dieser rasch alternierende, quasi-simultane Messmodus ist immer dann erforderlich, wenn (viele) Analyten, die abwechselnd im positiven bzw. im negativen Ionisationsmodus gemessen werden müssen, auch noch chromatographisch überlappen. Dabei muss extrem schnell (im unteren Millisekunden-Bereich) die Polarität gewechselt werden, damit diese Substanzen in einem Lauf erfasst werden können („fast Polarity Switching“). Solche Fälle sprechen für die Triple-Quad-Technik, da nur moderne QQQ-Systeme ausreichend schnelle Polaritätswechsel beherrschen. Bei Systemen, welche nicht über dieses Feature verfügen, muss in der Praxis der doppelte Aufwand investiert werden. Dann sind zwei getrennte Analysenläufe notwendig, einmal im positiven und einmal im negativen Modus.

Derzeit haben moderne QQQ-Systeme im SRM-Modus mit Recht noch immer den Ruf, dass sie die beste Nachweisstärke für sich verbuchen können. Voraussetzung dafür ist allerdings, dass die verfügbare Dwell-Time pro SRM-Übergang groß genug angesetzt werden kann, was bei Applikationen mit wenigen Substanzen der Fall ist. Bei Multimethoden unterliegen aber gerade diese Verweilzeiten einer zunehmenden Beschränkung. Je mehr Analyten erfasst werden sollen und je schneller die Chromatographie wird (UHPLC), desto enger wird der Kompromiss zwischen Empfindlichkeit durch möglichst lange Dwell-Time und der Anzahl notwendiger Datenpunkte über einen Peak.

High Resolution für mehr Informationen bei mehr Analyten

Wenn alle Sensitivitätsreserven mobilisiert werden müssen, bzw. bei einer größeren Anzahl von Zielanalyten (z. B. mehr als 100) ist die Verwendung von Retentionszeit-gesteuerten SRM-Fensteroptimierungen („Scheduled MRM“, „Timed MRM“ etc.) unumgänglich. Der Aufbau dieser Dwell-Time-Steuerungstabellen ist allerdings aufwendig und bei chromatographischen Verschiebungen fehleranfällig.

Bei QQQ ist es auch üblich bzw. in vielen Fällen durch Regulatorien erforderlich, dass ein zweiter SRM-Übergang (sog. Qualifier) als Bestätigung für das Targetsignal verwendet wird. Diese zusätzlich zu messenden Ionenspuren verschärfen den Zielkonflikt zwischen Sensitivität und Peak-Qualität noch weiter. Außerdem kommen als Qualifier meist Signale mit geringerem Response in Frage, was die letztlich erzielbare Nachweisstärke der Triple-Quad-Methode noch einmal reduziert. Mit zunehmender Anzahl an Zielanalyten verliert die Triple-Quad-Technik somit den Sensitivitätsvorteil über die Dwell-Time.

Die Stärken der HRMS im Full-scan-Modus kommen hingegen bei wachsendem Zielkomponentenumfang immer deutlicher zum Tragen. Für die Aufnahme hochauflösender Vollspektren sind keine substanzspezifischen Anpassungen erforderlich, im Extremfall müssen nicht einmal die Substanzen genau bekannt sein (Unknown bzw. Non Target Screening).

Während bei einem Triple-Quad im Vorfeld für jeden Analyten zumindest ein diagnostischer SRM bzw. oft zwei Übergänge (MRM) definiert und optimiert werden müssen, sind bei einem Q-HRMS-Instrument automatisch alle Produkt-Ionen sichtbar, ohne dass spezielle Anpassungen notwendig sind. Dabei können allein das Vorhandensein zusätzlicher diagnostischer Ionen – und auch deren Intensitätsverhältnisse – die Bestätigung einer Identifizierung wesentlich unterstützen. Das Analysenspektrum kann damit einfach (und auch kaum begrenzt) erweitert werden.

Beim Triple-Quad hingegen erfordert jede Implementierung zusätzlicher Substanzen die aufwändige Erstellung passender MRM-Übergänge, welche die Sensitivität von benachbarten Zielanalyten leicht schwächen kann. Der Aufwand für diese selektiven Optimierungen wird aber wiederum durch, im Vergleich zur HRMS, deutlich stärkere Signale und bessere Nachweisempfindlichkeit belohnt.

Der größte Vorteil von hochauflösenden Tandem-Massenspektrometern ist allerdings die akkurate Masse der Produkt-Ionen, die eine deutlich höhere Selektivität beinhalten, als die MRM-Übergänge am QQQ, welche auf Einheitsauflösung beruhen.

Durch Kombination von Trenntechniken zum Erfolg

Der bisherige Grundsatz, dass aufgrund der Sensitivitätsvorteile der Triple-Quad-Instrumente für rückstandsanalytische Fragestellungen keine HRMS infrage kommt, ist heute nicht mehr gültig. Nach neuesten Erkenntnissen scheint die Sensitivität von modernen HRMS adäquat und ausreichend zu sein, um einen Großteil der rückstandsanalytischen Fragestellungen befriedigend lösen zu können.

Die Auswertung von Daten mehrerer Studien [5, 6, 7, 8, 9] erhärtet die Annahme, dass bezüglich der Quantifizierungsmöglichkeiten keine gravierenden Unterschiede mehr zwischen hochauflösender Tandem-MS und Triple-Quadrupolen bestehen.

Für Screening-Aufgaben, aber auch für die Target-Analytik mit vielen Hundert Analyten, darf davon ausgegangen werden, dass die Vollspektren-Aufnahme mit simultan scannenden HR-Systemen (z. B. QqTOF) und abschließender sog. Post Run-Datenauswertung die zielführendste Vorgehensweise ist [10].

Unabhängig davon, welche MS-Tandemtechnik aktuell die dominierende Marktposition einnehmen kann, steht Folgendes fest: Angesichts der bisherigen Fortschritte und der permanenten Weiterentwicklung in der Chromatographie und der MS/MS sind auch zukünftig deutliche Verbesserungen hinsichtlich der Selektivität und Sensitivität bei allen Systemen zu erwarten. Dies gilt besonders für die synergistische Kombination dieser beiden leistungsstarken analytischen Techniken, die wohl auch weiterhin das Maß aller Dinge sowohl für Screening-Aufgaben als auch für hochsensitive, quantitative Bestimmungen bleiben werden.

AUTOR
Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit
Lebensmittelsicherheit Linz

Literatur:
[1] „Chemical Analysis of Non-antimicrobial Veterinary Drug Residues in Food”: Wiley Series on Mass Spectrometry; 1st Edition; ISBN-10:1118695070; Kapitel: “Capabilities and Limitations of High-ResolutionMass Spectrometry (HRMS): Time of Flight and Orbitrap”; 2017

[2] Kaufmann A, Butcher P.: Strategies to avoid false negative findings in residue analysis using liquid chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry, Rapid Commun Mass Spectrom. 2006; 20(23): 3566–3572.

[3] Van der Heeft E, Bolck YC, Beumer B, Nijrolder AW, Stolker AA, Nielen MW.: Full-scan accurate mass selectivity of ultra-performance liquid chromatography combined with time-of-flight and Orbitrap mass spectrometry in hormone and veterinary drug residue analysis, J Am Soc Mass Spectrom. 2009; 20(3): 451–463

[4] Nielen M W, Van Engelen MC, Zuiderent R, Ramaker R.: Screening and confirmation criteria for hormone residue analysis using liquid chromatography accurate mass time-of-flight, Fourier transform ion cyclotron resonance and Orbitrap mass spectrometry techniques, Anal Chim Acta. 2007; 586(1–2): 122–129

[5] Vannhaecke L, Van Meulebroek L, De Clercq N, Vanden Bussche J.: High resolution Orbitrap mass spectrometry in comparison with tandem mass spectrometry for confirmation of anabolic steroids in meat, Anal Chim Acta.; 2013; 767: 118–127

[6] Kaufmann A, Butcher P, Maden K, Walker W, Widmer M.: Quantification of anthelmintic drug residues in milk and muscle tissues by liquid chromatography coupled to Orbitrap and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, Talanta. 2011; 85(2): 991–1000

[7] Pozo OJ, Van Enoo P, Deventer K, Elbardissy H, Grimalt S, Sancho J, Hernandez F, Ventura R, Delbeke F.: Comparison between triple quadrupole, time of flight and hybrid quadrupole time of flight analysers coupled to liquid chromatography for the detection of anabolic steroids in doping control analysis, Anal Chim Acta. 2011; 684(1–2): 98–111

[8] Wang J, Chow W, Chang J, Wong J.: Ultrahigh-performance liquid chromatography electrospray ionization Q-Orbitrap mass spectrometry for the analysis of 451 pesticide residues in fruits and vegetables: method development and validation; J Agric Food Chem. 2014; 62(42): 10375–10391

[9] Wang J, Chow W, Leung D, Chang J.: Application of ultra-performance liquid chromatography and electrospray ionization quadrupole Orbitrap high-resolution mass spectrometry for determination of 166 pesticides in fruits and vegetables, J Agric Food Chem. 2012; 60(49): 12088–12104

[10] Stephen J. Lehotay, Yelena Sapozhnikova, Hans G.J. Mol: „Current issues involving screening and identification of chemical contaminants in foods by mass spectrometry“, Trends in Analytical Chemistry, Volume 69, Pages 62–75, June 2015

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