Non-Targets ohne Standards auswerten

Quantifizierung im Unknown-Screening

Mit der Non-Target-Analytik können unbekannte Kontaminanten zwar entdeckt und identifiziert werden, aber ohne Reinsubstanzen war ihre Quantifizierung bisher nicht möglich. Aktuelle Entwicklungen auf der Basis von Machine Learning könnten diese Einschränkung eliminieren und das Unknown-Screening auf ein neues Leistungsniveau bringen.
Bild 1: Sieben Verbindungen zeigen trotz gleicher Konzentrationen durch unterschiedliche Ionisationseffizienzen in der ESI-Quelle sehr unterschiedliche MS-Intensitäten. © Bild: Mit freundlicher Genehmigung von Fr. Prof. Anneli Kruve (Universität Stockholm)

Die gezielte Screening-Technik mittels HPLC-Massenspektrometrie-Kopplung hat sich schon längere Zeit einen etablierten Status in der analytischen Chemie und Forschung gesichert. Parallel dazu gewinnen auch Anwendungen von Non-Target-Screening und Suspected-Target-Screening rasch an Bedeutung. Während die klassische Target-Analytik nur auf bestimmte vordefinierte Komponenten untersuchen kann, erlauben die Non-Target-Methoden auch die Identifizierung von hunderten oder sogar tausenden von Substanzen, ohne dass Reinsubstanzen dafür verfügbar sein müssen (quasi nach dem Motto: Die Referenzsubstanz „befindet” sich im Computer, anstatt sich in der Standardlösung zu zersetzen.) Diese fortschrittlichen Techniken werden praktisch ausschließlich mit der Kombination von (U)HPLC mit hochauflösender (Tandem-)Massenspektrometrie betrieben. Die intensiv vorangetriebene Entwicklung auf diesem Gebiet und die Verbesserung von Identifizierungstools in Form von umfangreichen Spektren-Bibliotheken in Kombination mit Spezial-Software hat dazu geführt, dass mit diesem ungezielten Analysenansatz immer mehr und bisher unerwartete Substanzen identifiziert werden konnten. Dies betrifft nicht nur das weite Gebiet der Metabolomics, sondern auch den pharmazeutischen Bereich und insbesondere die Umweltanalytik. In der Lebensmittelanalytik konnten damit neue Kontaminanten entdeckt werden und die Identifizierung von illegalen Substanzen wurde ebenfalls verbessert.

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Gefunden und identifiziert, aber nicht quantifiziert

Bei all diesen beeindruckenden Fortschritten leidet die ungezielte Non-Target-Analytik jedoch an einem großen Manko: Sie kann die neuen Komponenten zwar identifizieren, aber nicht quantifizieren. D. h. man kennt zwar die neu auftauchende Kontamination im Lebensmittel, es fehlt aber die zur Risikobeurteilung notwendige Abschätzung der Belastungskonzentration.

Die Ursache dafür liegt zum überwiegenden Teil an der Verwendung der Elektrospray-Ionisation (ESI) in der LC-MS. Diese ist zu Recht am weitesten verbreitet und kommt dem Traum der Analytiker am nächsten, nämlich zumindest alle ionisierbaren Substanzen erfassen zu können. Dort, wo viele konkurrierende Atmospheric-Pressure-Ionisationstechniken (APCI, APPI) versagen, liefert ESI unabhängig von der Molekülgröße und Flüchtigkeit noch immer ein (Quasi-)Molekülion.

Das Ausmaß der Ionisierung, d. h. die Ionisationseffizienz kann sich dabei aber im Extremfall, in Abhängigkeit von der chemischen Struktur und den Messbedingungen, um das bis zum 100-Millionen-Fachen unterscheiden.

Diese teilweise stark differierende Ionisationseffizienz von unterschiedlichen Verbindungen schlägt sich direkt im ebensolchen Ansprechverhalten des Massenspektrometers nieder (Bild 1). Das Ansprechverhalten hängt wesentlich von der Struktur der Verbindung ab. Im positiven ESI-Modus besitzen hydrophobere und basischere Verbindungen in der Regel einen höheren Respons. Daher erfordert die quantitative Target-Analytik zwingend die Verfügbarkeit von reinen Standardsubstanzen, mit denen das LC-MS/MS quantitativ kalibriert werden muss.

Leider gibt es in der HPLC keinen sensitiven Detektor, der ein universelles Response-verhalten vergleichbar mit dem Flammenionisationsdetektor (FID) in der GC zeigt. Dessen Ansprechverhalten ist praktisch direkt proportional der Anzahl der Kohlenstoffatome, so dass nicht mit exakt derselben Substanz kalibriert werden muss, sondern auch z. B. Homologe dafür ausreichen oder eine Flächen-Normalisierung verwendet werden kann (z. B. relative Fettsäurezusammensetzung).

Es wird geschätzt, dass sich der Gesamtumfang der Ionisationseffizienz, sowohl im positiven als auch im negativen ESI, zumindest über sechs Größenordnungen erstreckt. Selbst bei manchen, sehr ähnlichen Komponenten, die sich nur als Stellungsisomere unterscheiden, wurden bis zu 40-fache Responseunterschiede (2- vs 4-Nitrophenol) bei gleicher Konzentration festgestellt.

Bild 2: Einfluss des anorganischen Laufmittel-Anteils bzw. des pH-Wertes auf die Ionenbildung. © Bild: Mit ­freundlicher Genehmigung von Fr. Prof. Anneli Kruve (Universität Stockholm)

Darüber hinaus können auch unterschiedliche HPLC-Bedingungen die Ionisationseffizienz erheblich beeinflussen. Die Zusammensetzung des Elutionsmittels hat einen zum Teil signifikanten Einfluss auf die LC-ESI-MS-Reaktion. Ein höherer Gehalt an organischen Lösungsmitteln kann den Response bis zu 10-fach erhöhen. Die Wirkung des pH-Werts kann sogar das 2000-Fache erreichen. Zusätzlich zum pH-Wert ist auch die Art des verwendeten Puffers maßgeblich für die Reaktion (Bild 2).

Schlüsseltechnologie „Machine Learning“

Aus diesen Gründen und wegen der Wichtigkeit von zumindest semi-quantitativen Non-Target-Screening-Applikationen wurde an der Universität in Stockholm eine Methode entwickelt, um die Ionisationseffizienz vorhersagen zu können (Anneli Kruve, 2019 [1]). Zur Unterstützung wurde mit dem sog. Machine Learning auf einen Teilbereich der künstlichen Intelligenz zurückgegriffen. Machine Learning versetzt IT-Systeme in die Lage, auf Basis vorhandener Datenbestände und mit Hilfe von Algorithmen Muster und Gesetzmäßigkeiten zu erkennen und daraus Lösungen zu entwickeln. Es wird quasi künstliches Wissen aus experimentellen Erfahrungen generiert. Die aus den Daten gewonnenen Erkenntnisse lassen sich verallgemeinern und für die Analyse von bisher unbekannten Daten verwenden. Solche Methoden werden schon sehr erfolgreich in der Sprach- und Texterkennung, der Bild- und Gesichtserkennung, der selbstständigen Selektion von Spam-Mails und der Relevanz von Webseiten für Suchbegriffe etc. eingesetzt.

Damit die Machine-Learning-Software eigenständig lernen und Lösungen finden kann, ist es notwendig, die Systeme mit applikationsrelevanten Datensätzen zu versorgen. Dazu wurden zuerst 3 000 Ionisationseffizienz-Bestimmungen im ESI positiv-Modus und mehr als 1 000 Messungen im ESI negativ-Modus durchgeführt.

Bild 3: Einfluss des MS-Typs auf die Ionisationseffizienz. © Bild: Mit freundlicher Genehmigung von Fr. Prof. Anneli Kruve (Universität Stockholm)

Parallel dazu wurden unterschiedliche Lösungsmittel als Eluenten eingesetzt, diverse LC-MS-Puffer getestet und ein großer pH-Bereich variiert. So kamen die üblichen Lösungsmittel wie Methanol und Acetonitril in unterschiedlichsten Mischungsverhältnissen mit Wasser zum Einsatz, der pH-Wert wurde von 2 – 10,7 variiert und die Messungen auf sieben verschiedene Massenspektrometer aufgeteilt. Beim Einfluss der Massenspektrometer-Typen zeigt sich, dass die MS-Signale zwar erhöht oder reduziert sein können, trotz der Änderungen der Absolutwerte der Ionisationseffizienz korrelieren sie jedoch gut von Instrument zu Instrument (Bild 3).

Struktur und pH bestimmen die Ionisierung

Ausgestattet mit speziellen Algorithmen beginnt die Software aus den Trainings-Experimenten jene relevanten Daten automatisiert zu extrahieren und zusammenzufassen, welche eine Vorhersage auf Basis der analysierten Daten ermöglichen sollen. Dazu sind noch Regeln für die Analyse des Datenbestands und das Erkennen von Mustern aufzustellen. Das System sollte auch in der Lage sein, Wahrscheinlichkeiten für bestimmte Ereignisse zu berechnen und sich im Idealfall auch eigenständig an Entwicklungen anzupassen und Prozesse auf Basis erkannter Muster zu optimieren. Wie zu erwarten, haben die Struktur der Komponenten und ihre chromatographischen Elutions-Charakteristika einen sehr großen Einfluss auf die Vorhersage. Seitens der Komponenten konnten, basierend auf der Struktur der Verbindung, sogenannte 2D-Deskriptoren entwickelt werden.

Letztlich ist maschinelles Lernen der Schlüssel zur Vorhersage der Ionisationseffizienz auf Basis der Strukturinformationen und der Zusammensetzung des Elutionsmittels. Damit konnte bis jetzt der durchschnittliche Vorhersagefehler für die Ionisationseffizienz auf den Faktor 2 reduziert werden. Das bedeutet, dass die vorhergesagte Ionisationseffizienz tatsächlich halb so groß oder auch doppelt so groß sein könnte.

Bild 4: Vorhergesagte vs gemessene Ionisationseffizienzen bzw. resultierende Konzentrationen. © Bild: Mit freundlicher Genehmigung von Fr. Prof. Anneli Kruve (Universität Stockholm)

In Bild 4 sind die gemessenen (X-Achsen) Ionisationseffizienzen (links) bzw. Konzentrationen (rechts) den vorhergesagten (Y-Achsen) Werten gegenübergestellt. Die Trainings-Daten der Ionisationseffizienzen sind als graue Ringe dargestellt, die Testmessungen als blaue Scheiben. Die Trainings-Daten dienen dabei zur Erstellung und Einengung des Modells. Die Test-Daten hingegen sind ein davon unabhängiger Datensatz von Verbindungen, die beim Training nicht verwendet wurden. Mit ihnen wird letztlich nur die Qualität der Vorhersage in Form von Übereinstimmung und Schwankungsbreite überprüft.

Sofort und auch retrospektiv quantifizieren

Im Vergleich zur bisherigen Situation ist dieser Schwankungsbereich bereits ein sehr großer Fortschritt, der eine relativ gute Abschätzung der neu identifizierten Substanzen möglich macht und das Unknown-Screening auf einen neuen Leistungslevel hebt.

Die Konzentrationen werden über die Peakfläche der LC-MS-Messung und der vorhergesagten Ionisationseffizienz berechnet. Diese Ergebnisse werden abschließend in instrumentenspezifische Werte umgewandelt, indem ein kleiner Satz von Verbindungen mit bekannter Konzentration parallel dazu vermessen wird.

Ein praktischer Einsatz dieser Methode beim Screening von Kontaminanten in Lebensmitteln (Zerealien und grüner Tee) ergab einen durchschnittlichen Fehlerquoten-Faktor von unter 5. Beim Vorhersagefehler sind sowohl die Ionisationseffizienz als auch eventuelle Matrixeffekte (Unterdrückungs- bzw. Erhöhungseffekte) bereits inkludiert.

Ein weiterer großer Vorteil des Verfahrens ist, dass nicht nur bei zukünftigen Analysen Referenzsubstanz-freie Quantifizierungen möglich sind, sondern damit auch bisherige Non-Target Analysen retrospektiv ausgewertet werden können. Und das bei praktisch allen Arten von LC-ESI-MS-Datensätzen. Die Voraussetzung dafür ist allerdings, dass zumindest einige Komponenten mitgemessen wurden, deren Konzentrationen bekannt sind. Diese müssen selbstverständlich immer unter den exakt gleichen Bedingungen (Gerät und Eluent) gemessen werden wie die identifizierten Substanzen, für die (noch) kein Kalibrierstandard vorliegt. Typischerweise kommen dafür zum Beispiel interne Standards in Frage, aber auch Qualitätskontroll-Proben mit Analyten bekannter Zusammensetzung oder Proben deren Komponenten im Rahmen anderer Analysen mithilfe von Kalibriersubstanzen quantifiziert wurden.

Fazit

Das neu entwickelte Verfahren ist ein wichtiger Schritt vorwärts in der zumindest semi-quantitativen Beurteilung von z. B. neu auftauchenden Kontaminanten in Lebensmitteln. Ebenso wie die Möglichkeit, neu identifizierte Komponenten retrospektiv in früher gemessenen Proben quantitativ beurteilen zu können, wenn einige Komponenten in diesen Proben mit Standardkalibriersubstanzen quantifiziert wurden.

Literatur
[1] Anneli Kruve: Making Nontargeted Liquid Chromatography–High-Resolution Mass Spectrometry Analysis Quantitative; LCGC Europe Volume 32, Issue 6, pg 320–322; June 01, 2019).

AUTOR
Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit
Lebensmittelsicherheit Linz

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