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Der HPLC-Tipp im MärzDie magische Zahl "3" in der HPLC…

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

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Der Fall
Als Kinder haben wir folgendes Spiel gespielt: Man nennt eine Zahl und jeder soll möglichst viele Gegenstände, Menschen etc. nennen, die dieser Zahl entsprechen und die – belegbar – mit seiner Person zu tun haben, z.B. 4 Brüder, die 4 ältesten Superman-Farbheftchen, die 4 kleinsten Spickzettel, usw. Derjenige hat logischerweise gewonnen, der die größte Anzahl bzw. bei „Stich“ die exotischsten, aber realen „4er-Gruppen“ nennen konnte. Versuchen wir es doch in abgewandelter Form in der HPLC und nehmen wir als Beispiel die „3“. Was könnte man nun mit der „3“ verbinden – Vernünftiges, Übliches, Unsinniges, Sinnvolles?

Die Lösung
1. Oft üblich, oft nicht sinnvoll:

A. Bei Kalibrierungen oder Wiederholmessungen 3 Werte – das mag üblich sein, sinnvoll ist es dennoch kaum, denn: 3 Werte sind zu viel, um z.B. eine Fehlinjektion zu beurteilen (Doppelinjektion ist ausreichend), zu wenig, um von einer statistischen Relevanz zu sprechen. Meine Meinung dazu: Die Praxis, aus 3 Werten Mittelwerte und Variationskoeffizienten zu ermitteln, sollte – auch unter „quick and dirty-Bedingungen“ – überdacht werden, es sei denn, man muss…

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B. 3 Stellen nach dem Komma – ich wüsste nicht, wo es in der HPLC Sinn macht.

2. Nicht überall üblich, dennoch sinnvoll:

A. Für eine Methode, die demnächst in die Routine geht, sollten im Rahmen der Robustheitsüberprüfung 3 Säulenchargen getestet werden.

B. Methodenentwicklung einer unbekannten Probe; auch wenn du wenig Zeit hast, denke an die „3 x 3“-Regel und verwende mindestens:
 3 unterschiedliche Säulentypen, z.B. C18, Biphenyl, „Mixed Mode“ oder eine „hydrophobe“ C18, eine „polare“ C18, eine „sehr polare“ C18 etc.
 3 verschiedene Gradienten mit 3 verschiedenen organischen Lösungsmitteln, z.B.100 % ACN, 50/50 ACN/MeOH, 50/50 MeOH/THF.
 3 unterschiedliche pH-Werte, z.B. pH = 2,5; 4,5; 7,0.

3. Die „3“ „hilft“ dir auch, wenn du spezifische Trennprobleme hast:

 „Dreckige“ Probe, schwierige Matrix? Bleib´ beim 3-µm-Material – bei <2-µm-Materialien wirst du womöglich sehr gute Nerven brauchen.
 Kleine und große Moleküle in der Probe? Probiere (auch) eine 300-Å-Säule – sterische Effekte können auch bei kleinen Molekülen die Selektivität beeinflussen.
 Musst du „viel“ injizieren oder brauchst du in jedem Falle starke Wechselwirkungen? Nimm ein 300-m2/g-Material: Durch die große spezifische Oberfläche minimierst du die Gefahr der Überladung und ermöglichst darüber hinaus durch die starke Belegung starke Wechselwirkungen.

4. Für die, die es schnell mögen/haben:

 Hast du so um die 5…7 Peaks zu trennen? Nimm „3/3/3“: 3 cm, 3 mm, 3- µm-Säule: Sie ist kurz genug, um schnelle Trennungen zu ermöglichen, dünn genug, um eine gute relative Massenempfindlichkeit zu gewährleisten, und die 3-µm-Teilchen sind einerseits robust genug und liefern anderseits bei einem Fluss von 1 ml/min ca. 3000 Böden, die für einfache Trennungen – vor allem im Gradientenmodus – oft mehr als genug sind.
 Hast du schnelle Trennungen/frühe Peaks? Nimm als „Sample Rate“ (Datenrateaufnahme) 30 Datenpunkte/s. Machst du UHPLC (wirklich UHPLC, d.h. Trennungen unter 2 min), sind womöglich 3 x 30 Datenpunkte/s, also 90 Datenpunkte/s, nötig, um sich keine Auflösungsverluste einzuhandeln.

Zum Schluss eine bemerkenswerte Regel, die auch mit der „3“ zu tun hat: Wenn bei unterschiedlichen Säulen der Quotient aus der Länge der Säule in cm und dem Teilchendurchmesser in µm konstant bleibt – nämlich 3 bzw. ca. 3 –, ergibt sich unter der Voraussetzung der gleichen Packungsqualität in etwa die gleiche Bodenzahl und somit die gleiche Auflösung – allerdings bei enormer Zeitersparnis: 30/10, 15/5, 10/3, 5/1,7.


Das Fazit
Man könnte versuchen, die Zahl 3 im Kopf zu behalten und mit bestimmten chromatographischen Parametern in Verbindung zu bringen.
© by Stavros Kromidas

www.kromidas.de

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