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Der HPLC-Tipp im OktoberFluss, Peakhöhe und Peakfläche

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

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Der Fall

Der HPLC-Tipp im Oktober: Fluss, Peakhöhe und Peakfläche

Vorbemerkung: Die Anregung zu diesem HPLC-Tipp entstand durch eine Anfrage von Dr. Siegfried Korhammer, Selb.

Wenn der Fluss sich ändert, ändert sich auch die Peakform – mal stärker, mal schwächer. So weit, so gut. Was machen nun die Peakhöhe und die Peakfläche? Ändern sie sich ebenso und wenn ja, ist dies merklich? Was wären schließlich die Konsequenzen?

Die Lösung

Es muss grundsätzlich zwischen Konzentrations- und Massen-empfindliche Detektoren unterschieden werden: Der UV- (UV-Vis, DAD) und der Fluoreszenzdetektor beispielsweise sind Konzentrations-empfindliche Detektoren, der Massendetektor bei der LC/MS- bzw. LC/MS/MS-Kopplung ein Massen-empfindlicher Detektor. D.h. im ersten Fall ist das Signal von der Konzentration, im zweiten von der Masse des Analyten abhängig. Wenn z.B. der Fluss halbiert wird, bleibt der Analyt in einer UV-Zelle doppelt so lange, es wird doppelt so lange UV-Licht absorbiert, die Peakfläche wird um Faktor 2 größer. Es gilt: F x A = m, Fluss x Fläche ist eine Konstante und das ist nichts anderes als die Masse - und sie muss ja unabhängig vom eingestellten Fluss konstant bleiben. Also: Bei einer Flussänderung ändert sich hier natürlich die Peakfläche, das Produkt jedoch aus Fluss und Peakfläche soll im Idealfall konstant bleiben (tut´s auch im Großen und Ganzen...). Theoretisch muss die Peakhöhe konstant bleiben. In der Praxis ändert sie sich doch (Änderung der Bodenzahl durch Änderung der Flussrate), aber bei weitem nicht so stark wie die Peakfläche. Bei einem Massen-empfindlichen Detektor verhält es sich genau umgekehrt (siehe Tabelle 1). "KAD": Konzentrationsabhängiger Detektor, "MAD": Massenabhängiger Detektor.

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Hinweis: Diese Zusammenhänge werden recht ausführlich in [1] dargestellt.

Das Fazit

Einige Konsequenzen:

1. Mit dem Ziel, die Retentionszeit zu verkürzen wird oft – sinnvollerweise – der Fluss erhöht. Bei kleinen Peaks jedoch (Verunreinigungen, Zersetzungsprodukte, Metaboliten) kann es zu Problemen mit der Integration kommen – die Peaks werden einfach kleiner! Bei 5-µm-Teilchen können sie bei höheren Flüssen durch die Abnahme der Bodenzahl auch unangenehm niedrig werden. Möglicher Ausweg: Kleinerer Säulendurchmesser und/oder kleinere Teilchen, in beiden Fällen erhöht sich die zu detektierende Analyt-Konzentration. Bei der LC/MS-Kopplung dagegen sollte man bei relativ hohen Flüssen arbeiten.
2. Ein Leck an einem UV-Detektor führt zu keiner Abnahme des Signals, denn: Es geht zwar „Masse“ verloren, aber die Konzentration bleibt konstant. Bei der LC/MS-Kopplung allerdings führen Verluste an Analyt (z.B. Memory-Effekt am Interface) schon zu einer Verschlechterung der Empfindlichkeit.

3. Flussschwankungen (Kurzzeitkonstanz der Pumpe nicht zufriedenstellend) führen bei Wiederholinjektionen im Falle eines UV-Detektors zu einem großen Variationskoeffizienten der Peakfläche. Bei einer LC/MS-Kopplung gibt es dagegen hier kaum nennenswerte Probleme.

[1] Daniel Stauffer in: Stavros Kromidas, Hans-Joachim Kuss (Hrsg.) Chromatogramme richtig integrieren und bewerten: Ein Praxishandbuch für die HPLC und GC, Wiley-VCH Verlag, ISBN 3-527 31774-5.

© by Stavros Kromidas
www.kromidas.de

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