HPLC-Tipp

Vom "Kult" der Bodenzahlen - oder was bewirkt eine hohe Bodenzahl?

Vom „Kult“ der Bodenzahlen – oder was bewirkt eine hohe Bodenzahl?

Der Fall
In letzter Zeit machen die Sub-2-µm-Teilchen sowie die Fused Core Materials von sich reden. So wird gerne auf die hohen Bodenzahlen dieser Materialien hingewiesen und folglich auf die damit verbundene wesentlich bessere Trennung. Betrachten wir folgende zwei Beispiele: In der Publikation eines Herstellers steht: „Unsere Fused Core Säule X weist 264800 Böden/m auf, die Säule Y von Firma Z mit porösen 1,8-µm-Teilchen lediglich 250970 Böden/m“. In einer Zweiten ist die Rede von zwei Säulen, beide mit 1,7-µm-Teilchen gefüllt, die eine weist eine Bodenzahl von 318690 Böden/m, die andere – die „schlechtere“ – von nur 272090 Böden/m auf. In beiden Fällen wird den Lesern eine klare Überlegenheit der Säule mit der höheren Bodenzahl suggeriert, auch entsprechende Chromatogramme werden gezeigt. Was bedeuten nun in der Praxis diese höheren Bodenzahlen?

Die Lösung
Bekanntlich ist die Auflösung R abhängig vom Trennfaktor α (Selektivität, Maß für die Trennfähigkeit des chromatographischen Systems), vom Retentionsfaktor k (Kapazität, Maß für die Stärke der Wechselwirkungen) und eben von der Bodenzahl N (Effizienz, Maß für die Bandenverbreiterung der Substanzzone). Da wir an dieser Stelle anhand der Formel für die Auflösung bereits Beispiele berechnet haben, verzichte ich hier auf eine detaillierte Diskussion und wir kommen direkt zu einigen Ergebnissen.

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Man betrachte drei der oben erwähnten Säulen: 264800 Böden/m, 250970 Böden/m und 318690 Böden/m. Bei Verwendung dieser modernen Materialien arbeiten wir üblicherweise mit kurzen Säulen, z.B. 50 mm, die sich für diese Säulenlänge errechneten Bodenzahlen lauten für die drei Säulen 13240, 12549 und 15936. Bei der Trennung eines kritischen Paars mit einer angenommenen Selektivität von α = 1,05 und einem Retentionsfaktor von k = 2 ergibt sich bei der ersten Säule eine Auflösung von 0,92, bei der zweiten „schlechteren“ Säule eine Auflösung von 0,89. Sorgt man nun für eine stärkere Wechselwirkung (z.B. Änderung der Eluentenzusammensetzung, hydrophobere stationäre Phase) und erreicht dadurch einen Retentionsfaktor von 5 (vorher 2), verbessert sich bei der ersten „guten“ Säule die Auflösung auf 1,15, bei der „schlechten“ Säule auf 1,12. Ich denke, Sie stimmen mit mir überein, dass der Gewinn an Auflösung bei der Säule mit der höheren Bodenzahl – unabhängig von der Stärke der Wechselwirkungen – zwar gegeben, aber eher gering ist. Welche Möglichkeiten haben wir nun, die Auflösung merklich zu verbessern?

Eine Verdoppelung der Säulenlänge von 50 auf 100 mm (Säule mit 264800 Böden/m) würde zu einer Verbesserung der Auflösung R auf 1,62 führen. Gelänge es dagegen bei der kurzen 50-mm-Säule, die Selektivität von α = 1,05 auf lediglich α = 1,08 zu erhöhen (pH-Wert-Änderung, Modifier-Zugabe, MeOH statt ACN usw.), ergäbe sich eine Auflösung von 1,79, bei der „schlechten“ Säule von immerhin 1,74 – also immer noch besser als mit der effizienteren Säule (höhere Bodenzahl), auch wenn sie bei gleicher Selektivität doppelt so lang wird.

Wie sieht es nun bei der Säule mit der höchsten Bodenzahl aus (1,7 µm, 318690 Böden/m)? Eine 50-mm-Säule würde bei α = 1,05 und k = 5 eine Auflösung R von 1,26, eine 100-mm-Säule von 1,78 liefern. D.h. die „beste“ Säule (318690 Böden/m) und in doppelter Länge liefert bei einer Selektivität von α = 1,05 eine Auflösung von 1,78, während die „schlechteste“ Säule (250970 Böden/m) trotz einer Länge von 50 mm eine Auflösung von 1,74 liefert (bei einer um Faktor 2 kürzeren Retentionszeit) – wenn es gelingt, die Selektivität etwas zu verbessern. Dies alles gilt für isokratische Trennungen.

Um überhaupt mithilfe von Chromatogrammen merkliche Unterschiede von Trennungen zu zeigen, werden in Hersteller-Prospekten daher meist isokratische Trennungen gezeigt. In der Praxis jedoch werden häufig Gradiententrennungen gefahren – und dort spielt die Bodenzahl eine weit weniger wichtige Rolle: Dadurch, dass die Peaks nach vorne „geschoben“ werden, sind sie per se schmal. Das bedeutet, der Vorteil einer hohen Bodenzahl nimmt bei Gradientenläufen an Bedeutung ab. Und wie wir weiter oben gesehen haben, beeinflusst die Selektivität die Auflösung überhaupt viel stärker als eben die Bodenzahl.

Das Fazit
Selbstverständlich ist die Bodenzahl eine wichtige Größe und deren Erhöhung kann zur Verbesserung der Auflösung führen, aber: Auch ein Unterschied von 50000 oder 70000 Böden/m macht sich bzgl. Auflösung in der Praxis eher wenig bemerkbar. Das wäre vor allem im Falle von 50-mm-Säulen, von Flüssen um ca. 0,8…1,2 ml/min und von Gradientenläufen zu bedenken. Der Vorteil von höheren Bodenzahlen kommt bei längeren Säulen, isokratischen Läufen und hohen Flüssen zum Tragen. Das bedeutet:

Wenn man 1. über eine U(H)PLC-Anlage verfügt bzw. Fused Core Materials verwendet und diese zwei Tools nicht für schnelle Trennungen, sondern für eine Verbesserung der Auflösung nutzen möchte, und 2. die Verbesserung der Auflösung nicht über die Selektivität, sondern par tout über die Effizienz (Bodenzahl) erreichen möchte, dann lautet die Strategie: Möglichst lange Säule, möglichst kleine Teilchen (bzw. Fused Core), möglichst hohe Flüsse.

von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

© by Stavros Kromidas
www.kromidas.de


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