HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Die „kleinen“ Juli-Tipps

Von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Heute wollen wir uns zum einen mit dem Behältnis und zum anderen mit der Peakfläche beschäftigen.

Probleme mit dem Behältnis

•Proteine – aber auch andere Moleküle – können an Polyethylenoberflächen sorbiert werden, deswegen sollten Polypropylen- oder Glasgefäße verwendet werden. Es sollte jedoch Borosilikatglas möglichst vermieden werden, auch hier ist eine Physisorption durch Adhäsionskräfte denkbar. In jedem Fall empfiehlt sich entweder eine gründliche Behandlung der Glasoberfläche mit HCl/HNO3 und/oder deren Silylierung beispielsweise mit Trichlormethylsilan.

•In einer Studie wurde das Wachstum von Mikroorganismen in Abhängigkeit vom Aufbewahrungsgefäß untersucht. Mikrobiologische Tests haben gezeigt, dass bereits nach einer Woche 1/4 bis 1/3 mehr Mikroorganismen in einer Polypropylenflasche im Vergleich zu einer Flasche aus Braunglas nachzuweisen sind.

•Ein weiterer Grund, gegenüber Polypropylen etwas vorsichtig zu sein, ist, dass SDS (Natriumdodecysulfonat), welches häufig in der Ionenpaarchromatographie verwendet wird, Weichmacher aus Polypropylen herauslösen kann. Die Folge sind Geisterpeaks.

Probleme mit der Peakfläche

Obwohl Ihre Säule im Gleichgewicht ist (konstante Retentionszeit), wird die Peakfläche erst mit der Zeit stabil: Die Reproduzierbarkeit nimmt bei wiederholten Injektionen spürbar zu. Folgende Ursachen kämen in einem solchen Fall in Frage:

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•Die Deuterium-Lampe war am Anfang noch nicht warm (es bedarf nach dem Einschalten ca. 20 min, bis sie betriebsbereit ist).

•Aktive Zentren an der Oberfläche der stationären Phase, aber auch die Oberfläche von Stahlkapillaren, Fritten oder Dichtungen werden langsam mit dem Analyten gesättigt. Erst dann bleib(en)t der(die) Analyt(e) auf dem Weg vom Probengeber zur Detektorzelle nirgends „hängen“.

•Nehmen wir an, Sie haben neue Dichtungen eingebaut. Im Falle von ACN im Eluenten, bedarf es einer gewissen Zeit, bis die Dichtungen ihren End-Quellzustand erreicht haben. Erst dann können Sie mit konstanten Peakflächen rechnen. Um dieses Problem zu vermeiden, können Sie die Dichtungen in ACN/Isopropanol aufbewahren. Oder aber, die Anlage wird direkt nach dem Einbau von neuen Dichtungen ohne Säule bei erhöhtem Fluss/Druck ca. 5...10 min lang gespült: Die Dichtungen quellen auf und man kann jetzt mit der Messung beginnen.

•Die Probenlösung war im Kühlschrank aufbewahrt gewesen und es dauert natürlich eine gewisse Zeit, bis jene die Umgebungstemperatur angenommen hat. Bei empfindlichen Messungen kann die Temperaturabhängigkeit des (Injektions-)Volumens sich schon bemerkbar machen. Denken Sie in diesem Zusammenhang auch an eine eventuelle Temperaturdifferenz zwischen Standard- und Probenlösung! Zum Schluss auch folgender Hinweis für einen zwar seltenen, dennoch immer wieder auftretenden Fall: Wenn die Temperatur sich allmählich ändert, siehe weiter oben, könnte eine ebenso langsame, schleichende Änderung des pH-Wertes der Probenlösung einsetzen, weil der pH-Wert temperaturabhängig ist. Durch die Änderung des pH-Wertes kann nun die UV-Absorption der Analyte sich ebenfalls ändern, denn die UV-Absorption einiger Substanzen (zum Beispiel Ascorbinsäure, Barbiturate usw.) ist pH-Wert abhängig.© by Stavros Kromidas

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