HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Überbefund bei Gehaltsbestimmung – eine tückische Ursache

Von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Sie arbeiten mit einem ganz normalen linearen Gradienten und Ihr Ziel ist die Gehaltsbestimmung von mehreren Peaks. Ihre Anlage ist qualifiziert und Sie wissen, Ihr Probengeber und Ihre Pumpe arbeiten einwandfrei. Der Gehalt einiger Peaks ist okay, bei einigen oder bei einem finden Sie jedoch einen leichten, aber reproduzierbaren und signifikanten Überbefund. Sie können durch mehrere Versuche alle Ihnen bekannte Ursachen ausschließen. Gibt es noch weitere ,,verrückte" Ursachen für dieses Phänomen?

Die Lösung

Wahrscheinlich jede Menge – dafür ist HPLC bekanntlich ein Buch mit 14 Siegeln! Ich möchte Ihnen hier eine nennen:

Fahren Sie einen Blindgradienten. Wichtig dabei ist, dass Sie den Anstieg (das Profil) des Gradienten sehen können. Geben Sie gegebenenfalls dem Eluenten B 0,1...0,2 % Aceton oder sonst einen UV-Modifier zu. Beobachten Sie einen linearen Anstieg des Gradienten oder haben Sie womöglich ein leicht konkaves Profil (kleiner ,,Hängebauch")? Wenn letzteres festgestellt wird, überprüfen Sie, ob vielleicht der/die Problempeak(s) just bei der Eluentenzusammensetzung eluiert, wo eine merkliche Differenz zwischen dem erwarteten linearen und dem tatsächlichen konkaven Verlauf resultiert (benutzen Sie eventuell ein Lineal, um den erwarteten linearen Gradienten zu simulieren). Wenn das so sein sollte, dann haben Sie bei den aktuellen Bedingungen doch eine gewisse Volumenkontraktion. D.h., dass beispielsweise die Pumpe nicht den eingestellten Fluss von 1 ml/min sondern vielleicht nur 0,97 ml/min fördert – und das eventuell recht reproduzierbar. Das ist ein typischer Fall für einen systematischen Fehler. Ergebnis ist eine leichte Zunahme der Fläche – und damit des Befundes –, weil ja das Produkt aus Fluss mal Fläche eine Konstante ist.

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Das Fazit

Gelegentliche Luftpeaks, die unter dem Peak eluieren und die Fläche, aber nicht die Höhe beeinflussen, koeluierende Verunreinigungen mit identischem UV-Verhalten wie die interessierende Komponente und oben beschriebener Fall sind leider Gottes äußerst schwer zu findende Ursachen für mangelnde Reproduzierbarkeit bei Gehaltsbestimmungen über die Peakfläche.

ã by Stavros Kromidas
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