HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Überprüfung der Robustheit von Systemen mit gepufferten Eluenten

von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Je komplexer der Mechanismus bei der Wechselwirkung eines Analyten mit der stationären Phase ist, um so labiler sind die Gleichgewichte, um so anfälliger ist die Methode. Mit anderen Worten: Die Robustheit in solchen Systemen ist ein durchaus kritischer Punkt. Es ist sicherlich bekannt, dass im Rahmen der Überprüfung der Robustheit von Methoden mit gepufferten Eluenten u.a. auch der pH-Wert im relevanten Bereich variiert werden sollte. Wie kann man hier ökonomisch vorgehen?

Die Lösung

Besorgen Sie sich die pKs-Werte Ihrer Substanzen! Wenn diese nicht vorliegen, lohnt es sich schon beim Auftraggeber nachzufragen oder bei Bedarf jene mit Hilfe der Substanzstruktur und entsprechenden Softwareprogrammen (beispielsweise http://acdlabs.com) zu berechnen. Der Bereich um den pKs-Wert nämlich ist der interessanteste Bereich überhaupt: Dort ist häufig die Selektivität des chromatographischen Systems am besten, die Robustheit am geringsten. In Bild 1 wird in einem fiktiven Beispiel die Abhängigkeit der Retentionszeit zweier starker Basen vom pH-Wert des Eluenten dargestellt. Im sauren bzw. im alkalischen pH-Wert-Bereich wird fast Koelution (also eine mangelnde Selektivität) beobachtet, die Robustheit dagegen ist gut: Kleine, im Alltag oft unvermeidbare Veränderungen des pH-Wertes führen kaum zu einer nennenswerten Retentionszeitverschiebung. Anders bei einem pH-Wert zwischen ca. 4,5 und 5: Maximale Selektivität (maximale Differenz in der Retentionszeit der 2 Basen), aber eine äußerst dürftige Robustheit: Winzige pH-Wert-Verschiebungen können zu regelrechten Retentionszeitsprüngen führen.

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Bild

Bleibt es nicht aus, dass Sie bei einem solchen ungünstigen pH-Wert arbeiten müssen, so sollten Sie Ihr „Bestes“ geben, um für einen möglichst konstanten pH-Wert zu sorgen: Geeigneter Puffer für diesen pH-Wert-Bereich und ausreichende Ionenstärke – hier mindestens 20 mMol. Und, sicher ist sicher: Messen Sie bei isokratischen Läufen den „pH-Wert“ des fertigen, frischen Eluenten, seinen „pH-Wert“ nach 2...3 h und den „pH-Wert“ des Eluats, also das, was nach der Säule eluiert. Ergeben sich große Schwankungen bei den 3 „pH-Werten“, handelt es sich womöglich um einen nicht-robusten Eluenten. Bei Gradienten-Trennungen ist die Sache etwas komplizierter. Wir werden an einem späteren Zeitpunkt darauf zurückkommen, heute nur so viel: Vormischen ist das Minimum, was man hier machen sollte.

Das Fazit

Das „A“ und das „O“ in gepufferten Systemen ist die Konstanz des pH-Wertes des Eluenten. (Ich hoffe, Sie denken auch an eine eventuelle. pH-Wert-Differenz zwischen Probenlösung und Eluent...) Um zu erfahren, was „Sache“ ist, und um zu vermeiden, dass der relevante Bereich auf „gut Glück“ oder mit einem großen, eventuell unnötigen Aufwand überprüft wird, helfen hier gezielte Experimente nach Ermittlung/in Erfahrung bringen der pKs-Werte der interessierenden Substanzen oder zumindest der Hauptkomponente.© by Stavros Kromidas

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