HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Säulenlänge, Fluss und Retentionszeiten bei Gradienten-Trennungen

Von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken 

Der Fall

Hintergrund: Wichtig in der HPLC sind ,,vernünftige" Wechselwirkungen. So heißt es beispielsweise für isokratische Trennungen: Die interessierenden Komponenten sollten mit einem Retentionsfaktor von ca. 2...8 eluieren. Hier haben wir einen sinnvollen Kompromiss zwischen ausreichend starken Wechselwirkungen, robusten Bedingungen und akzeptabler Retentionszeit. Bei Gradienten-Trennungen gilt analog der mittlere Retentionsfaktor k‡–:

Formel 1

k‡– = mittlerer k-Wert; Analyt befindet sich in der Mitte der Säule (Längsrichtung)

tG = Gradientendauer [min]

F = Fluss [ml/min]

Vm = Säulenvolumen

D%B= Änderung von B während der Gradientenelution

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S = Steigung der %B/tG-Kurve; für kleine Moleküle kann für S ein Wert von ca. 5 angenommen werden.

Ein optimaler k‡–-Wert wäre etwa 5, damit vereinfacht sich die Gleichung, nach der Gradientendauer aufgelöst, wie folgt:

Formel 2

Jetzt möchten wir uns anschauen, welche Retentionszeiten sich bei einigen typischen Kombinationen von Säulendimensionen und Fluss ergeben.

Die Lösung

Betrachten wir zunächst eine klassische 250 × 4,6-mm-Säule bei einem Fluss von 1ml/min und einem Gradienten von 20 % B auf 80 % B. Die Gradientendauer beträgt ca. 37,5 min:

Formel 3

Bemerkung 1:

Es hat sich gezeigt, dass bei Gradienten-Trennungen – anders als im isokratischen Modus – die Säulenlänge in der Regel nicht so wichtig ist: Die Probe wird quasi am Säulenkopf aufkonzentriert, die einzelnen Komponenten verlassen sukzessiv bei Erhöhung des Methanol/Acetonitril-Anteils im Eluenten die stationäre Phase. Die Säulenlänge – und mit ihr die Bodenzahl – ist hier zweitrangig, zumal wir beim Gradienten ohnehin schmale Peaks erhalten.

An einer 125 × 4-mm-Säule nun beträgt bei gleichen Bedingungen die Gradientendauer ca. 18,75 min:

Formel 4

Bemerkung 2:

Wir haben uns bereits früher über das Gradientenvolumen (Gradientendauer mal Fluss) unterhalten: Je größer es ist, um so besser (zum Beispiel durch höheren Fluss bei konstanter Gradientendauer) bzw. um so schneller (zum Beispiel durch höheren Fluss bei kürzerer Gradientendauer) ist die Trennung. So beträgt die Gradientendauer an der eben erwähnten Säule (125 × 4 mm) bei einem Fluss von 2 ml/min ca. 9,38 min – bei gleicher Auflösung wie in den 2 erstgenannten Fällen!

Formel 5

Bei relativ einfachen Trennungen (Anzahl der Peaks kleiner ca. 10) sollte man in jedem Falle auch an kürzere Säulen denken. An einer 75 × 4-mm-Säule und einem Fluss von 2 ml/min beträgt die Gradientendauer ca. 5,63 min:

Formel 6

Dass für ,,nur" 4...5 Peaks eine 20...30-mm-Säule ausreichend ist, liegt auf der Hand: Das abgebildete Chromatogramm mit einer 25-mm-Säule hat Daniel Stauffer, Roche, Basel, im Rahmen eines Kurses auf die ,,Schnelle" an einer ,,uralten" Apparatur erzeugt. Es sei nur am Rande erwähnt, dass noch jede Menge ,,Luft" für eine weitere Optimierung vorhanden ist.

Das Fazit

Wenn kein driftiger Grund vorliegt, wie zum Beispiel eine stark kontaminierte Probe oder eine problematische Matrix, sind lange Säulen für Gradienten-Trennungen denkbar ungeeignet, noch besser: unnötig. Rechnet man mit weniger als 10...15 Peaks, könnten sogar 125-mm-Säulen ,,zu" lang sein.

Nachdem die Trennung steht, sollten Sie den Fluss erhöhen – Sie können mit einer angenehmen Überraschung rechnen: Die Trennung wird besser oder die Trennung ist bei gleicher Auflösung früher beendet. Der Nachteil dabei: Die Flächen nehmen ab.

ã by Stavros Cromidas
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