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HPLC-TippEinstellparameter und Variationskoeffizient

Der Fall:
Einstellparameter wie Zeitkonstante („response time“, „time constant“), Peakwidth, Datenrateaufnahme („sample rate“), Bandwidth etc. können die Integration und somit Peakfläche und Befund stark beeinflussen. Wir haben uns bereits darüber unterhalten, Details finden sich in [1] und [2]. In wieweit beeinflussen nun diese Parameter auch die Streuung der Werte im Falle von Wiederholmessungen?

Die Lösung

Nachdem ich in der Literatur diesbezüglich nicht fündig geworden bin, wurde in einer kleinen Studie an einer UPLC-Anlage der Einfluss diverser Einstellparameter auf den Vk systematisch untersucht. Dazu wurde zunächst mithilfe von Systemeignungstests die Zuverlässigkeit der Anlage überprüft. Anschließend wurden je zehn Wiederholmessungen aus einem Vial bei unterschiedlichen Einstellparametern durchgeführt. Die relative Standardabweichung srel (oder Variationskoeffizient, Vk) ist ein Maß für die Streuung von Werten. Ergäben sich unterschiedliche Vks, müsste dies durch die unterschiedlichen Einstellungen herrühren. In Bild 1 sind einige Ergebnisse in kompakter Form wider gegeben: Gezeigt wird dort die Abhängigkeit des Variationskoeffizienten von der Sample Rate und von der Zeitkonstante für zwei Peaks.
Kommentare:
Abhängigkeit des Vk von der Sample Rate:

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HPLC-Tipp: Einstellparameter  und Variationskoeffizient

Bild oben links (Zeitkonstante TC = 0, keine Glättung, keine „Verfälschung“ des Chromatogramms): Bei 10 Hz beträgt der Vk für die Fläche 0,2 %, bei 20 Hz ca. 0,5 %, also mehr als Faktor 2.

Bild oben rechts (Zeitkonstante TC = 0,1 s): Bei 5 Hz beträgt der Vk 0,3 %, bei 10 Hz 0,6 %.

Abhängigkeit des Vk von der Zeitkonstante:

Bei einer Zeitkonstante von TC = 0 beträgt der Vk bei 10 Hz 0,2 %, bei einer Zeitkonstante von 0,1 s beträgt dagegen der Vk bei der gleichen Sample Rate von 10 Hz 0,6 %.

In Bild 2 ist die Abhängigkeit des Vk von der Zeitkonstante, in Bild 3 seine Abhängigkeit von der Retentionszeit dargestellt.

Die Befunde sind die erwarteten, hier sind sie lediglich statistisch belegt worden:

1. Je kleiner die Zeitkonstante ist und je früher die Peaks eluieren, umso größer ist der Variationskoeffizient.

2. Bei größeren Werten für die Zeitkonstante (ab ca. 1 s) und bei den späteren Peaks (ab ca. 1 min) sind die Vks der Peakhöhen und der Peakflächen ähnlich. Bei sehr frühen Peaks und bei sehr kleinen Zeitkonstanten ist der Vk der Peakhöhe kleiner – die Peakflächen streuen mehr.

Also halten wir fest, der Vk ist abhängig von den Einstellungen. Denn je nach Stärke des Rauschens – die ja z.B. sowohl von der Zeitkonstante als auch von der Sample Rate abhängig ist – kann der Peakanfang und das Peakende reproduzierbar oder weniger reproduzierbar gefunden werden. Diese Problematik kann bei einem Methodentransfer eine Rolle spielen, nach meinen Erfahrungen werden in den Prüfvorschriften nicht immer alle Einstellungen angegeben.

Vorschlag:
• Man stelle bei der Entwicklung von empfindlichen Methoden (Reinheit, Zersetzungsprodukte) zunächst solche Werte ein, die es erlauben, möglichst „alle“ Peaks zu sehen und sie mit der bestmöglichen Auflösung zu trennen, d.h. man strebe eine optimale qualitative Information an, z.B: Eine Zeitkonstante von, sagen wir, 50 ms und eine Sample Rate von 20 oder 40 Hz.

  • Man bestimme jetzt durch Wiederholmessungen den Vk bei diesen Einstellungen.
  • Anschließend verändere man die Einstellungen, z.B. die Zeitkonstante auf 100 ms und die Sample Rate auf 10 Hz (negativ: besonders frühe Peaks werden breiter, positiv: das Rauschen wird kleiner) und wiederhole die Messungen, Frage: Ist jetzt der Vk kleiner geworden, sind dabei aber eventuell sehr kleine Peaks „verschwunden“ oder werden sie schlechter getrennt oder habe ich bei einem kleineren Vk eine mir ausreichende Auflösung? Bei Bedarf wiederhole man die Messungen bei noch einmal veränderten Einstellungen.

Man findet dadurch schwarz auf weiß den für diese Methode bei diesen Bedingungen vernünftigen Kompromiss, was die Einstellparameter betrifft: Eine möglichst gute Peakform und somit eine gute Auflösung bei einem akzeptablen Vk.


Das Fazit

Nachdem nun die Einstellparameter den Vk beeinflussen, wäre zu überlegen, ob nicht die oben beschriebene Testung und die anschließende Festlegung der Zahlenwerte für die Einstellparameter Bestandteil der Methodenentwicklung/Methodenvalidierung sein sollte. Könnte man sich nicht dazu entschließen, sollten wenigstens die verwendeten Zahlenwerte in die Prüfvorschrift aufgenommen werden. Ansonsten besteht bei Methodenübernahme/Methodentransfer die Gefahr, dass unterschiedliche Ergebnisse falsch gedeutet oder sie anderen Ursachen zugeschrieben werden.

  1. S. Kromidas, H-J. Kuss (Herausgeber): Chromatogramme richtig integrieren und bewerten: Ein Praxishandbuch für die HPLC und GC, Wiley-VCH Verlag, 2008, ISBN 3-527-31774-5.
  2. H.J. Kuss, S. Kromidas (Eds.): „Quantification in LC and GC – A practical guide to Good Chromatographic Data“, Wiley-VCH, 2009, ISBN978-3-527-32301-2 (ausführlichere und aktualisierte Version von [1]).

© by Stavros Kromidas
www.kromidas.de

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