HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Unterschiedliche Peakflächen beim Methodentransfer, Teil 1



Der Fall
Unterschiedliche Peakflächen – und somit unterschiedliche Gehalte – sind leider Gottes nichts Ungewöhnliches beim Methodentransfer. Wir unterstellen, dass durch Gerätequalifizierung in den betreffenden Labors technische Fehler, die zur Änderung der Peakfläche führen könnten, ausgeschlossen werden können: Fluss, Wellenlänge, Injektionsvolumen sind in Ordnung. Der Einfachheit halber gehen wir weiterhin von baugleicher HPLC-Hardware aus. Nun, es gibt für das hier besprochene Problem eine Reihe von Ursachen, an die man zunächst nicht ohne weiteres denken würde. Heute werden wir uns mit eher physikalischen/chemischen Ursachen beschäftigen, im März geht es dann um Probleme bei der Anwendung der Methode (Auslegung von Spezifikationen und Unterschiede bei den Einstellparametern).

Die Lösung
Trotz technisch einwandfreien und baugleichen HPLC-Anlagen, ordnungsgemäßem Zubehör und guter Qualität der eingesetzten Chemikalien und Lösungsmittel sind kleine Unterschiede von Labor zu Labor denkbar, Unterschiede, die letzten Endes das quantitative Ergebnis beeinflussen können, nachfolgend sind einige Beispiele aufgeführt:

„Verlust“ an Analyt:
Teilweise irreversible Adsorption eines Wirkstoffs an der metallischen Injektionsnadel (Physisorption), die Kollegen im anderen Labor hatten wegen ähnlicher Probleme die Stahlnadel gegen eine aus Messing ersetzt. Adsorption in der Spritze aufgrund von sich dort befindenden Ablagerung oder einer „Schmutzschicht“. Oder es werden einmal braune, einmal weiße Vials verwendet oder aber die Glasoberfläche der Vials hat einfach eine andere Beschaffenheit. Die Problematik mit der Oberfläche und der Gefahr einer Sorption können wir auch auf Septen, Kapillaren (Stahl- vs. PEEK-Kapillaren), Filter usw. ausdehnen.
Probengeber okay, dennoch „falsches“ Injektionsvolumen, falsche Konzentration bzw. Substanzverlust:
Hier einige Gründe:

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  • Luft in der Spritze (begünstigt durch Schmutz dort).
  • Verstopftes Nadelloch (Salz, Septumabrieb, eingetrocknete Matrixbestandteile usw.).
  • In einem Labor ist das Lämpchen im Probenraum des Probengebers ein-, im anderen Labor ausgeschaltet und es handelt sich um eine lichtempfindliche Substanz...
  • Vial ist dicht verschlossen, ein Druckausgleich ist nicht möglich. Derartige Probleme sind bei unterschiedlichen Flüssigkeitshöhen am stärksten bemerkbar.
  • Geänderte Konzentration durch Verdampfen von Lösungsmittel bei längerer Verwendung einer Standardlösung, am stärksten bei Microvials bemerkbar.

Weitere Ursache: Detektor.

  • Lampe ist alt, dadurch ändert sich das Peak/Rausch-Verhältnis und bei kleinen Peaks in der Nähe der Bestimmungsgrenze zwangsläufig auch die Integration.
  • Lampe okay, aber trübe Linsen oder verschmutzte Zelle.

Kleine Unterschiede an HPLC-Geräten gleichen Typs:

  • Totvolumen durch etwas längere/kürzere/dünnere Kapillaren.
  • Eine etwas anders geartete Mischkammer (manchmal macht sogar etwas aus, ob eines der Fittings aus Stahl oder PEEK ist) oder es wird gar ein zusätzlicher (dynamischer) Mischer verwendet.

Bei den letztgenannten Fällen kann sich die Peakform etwas ändern, dadurch auch die Auflösung und obwohl man sich bezüglich Auflösung innerhalb der geforderten Spezifikation befindet, wird etwas anders inegriert und es ergibt sich eine andere Peakfläche.

Das Fazit
Auch ohne technische Probleme im wörtlichen Sinne des Wortes sind Differenzen bei quantitativen Ergebnissen durch eine Reihe von kleinen Unterschieden in den Labors denkbar. Aus diesem Grunde ist eine minutiöse Auflistung der verwendeten Hilfsmittel und eine genau Beschreibung der Tätigkeiten wenigstens bei problematischen Proben/Matrizes unerlässig. Zweifelsohne stellt ein gegenseitiger Besuch der Labormitarbeiter das probateste Mittel dar, um potenzielle Probleme im Vorfeld(!) ausfindig zu machen.

© by Stavros Kromidas

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