HPLC-Tipp
Der HPLC-Tipp
Säulendimensionen und Gradiententrennungen
Von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken
Der Fall
Wir haben uns bereits im August über Säulendimensionierung bei Gradiententrennungen unterhalten. Meine häufige Diskussionen mit KollegInnen an der ,,Front" veranlassen mich jedoch erneut das Thema aufzugreifen. Ich stelle immer wieder folgende Bedingungen bei Gradiententrennungen fest: Säule, 125 × 4 mm, Fluss, 1ml/min, Gradientendauer um die 20 min. Das muss nicht unbedingt so sein: Würde man beispielsweise einen Fluss von 1,5 ml/min wählen, wäre die Trennung bei gleicher Auflösung bereits nach ca. 13...14 min beendet. In beiden Fällen ergibt sich in etwa das gleiche Gradientenvolumen: 1 ml/min × 20 min = 20 ml und 1,5 ml/min × 13 min. = 19,5 ml. Dass es eleganter ist, ein gewünschtes Gradientenvolumen (und damit eine bestimmte Auflösung) eher über den Fluss (Analysendauer!) als über die Gradientendauer einzustellen, leuchtet sicher ein. Heute wollen wir uns jedoch mit dem Säulenvolumen (sprich: Säulendimensionen) beschäftigen. Wie wichtig ist es bei Gradiententrennungen?
Die Lösung
Recht unwichtig! Es gibt kaum einfache Trennungen, die zwar an einer 125 × 4-mm-, aber nicht an einer 50- oder 75 × 4-mm-Säule ,,laufen". Das bedeutet konkret folgendes: Erwarten Sie nur 7...10 Peaks, so wäre es in jedem Fall lohnenswert, sich von dem Klassiker 125 × 4 mm in Richtung 50 oder 75 × 4 oder 4,6 mm zu bewegen. Sie sparen Zeit.
Um Sie liebe Leserin, lieber Leser zumindestens zum Nachzudenken zu ermutigen, möchte ich Ihnen an einem Fall schildern, dass es an ganz normalen Anlagen sogar mit ,,Mini-Säulen" klappt: In einem befreundeten Unternehmen haben wir im Rahmen eines Schnellexperiments versucht – ohne irgendetwas an der Apparatur oder sonstiges zu verändern – eine einfache Trennung von 5 Peaks an einer 150 × 4,6 mm auf eine 10 mm × 2 mm, 2 mm zu übertragen. Es hat auf Anhieb funktioniert, die Retentionszeit lag bei 4 min (siehe Bild). Natürlich gibt es hier jede ,,Menge" Optimierungs-/Verbesserungspotenzial, aber das war in diesem Fall nicht unsere Absicht gewesen.
Das Fazit
Beim Gradienten wird die Probe quasi am Säulenkopf angereichert und anschließend durch Erhöhung des organischen Anteils im Eluenten sukzessiv von der Säule eluiert. Bei relativ einfachen Trennungen und Fehlen von ,,unapettitlichen" Matrices erweist sich das Säulenvolumen meist als zweitrangig, die Optimierung sollte über das Gradientenvolumen erfolgen. Denken Sie bitte bei einfachen Trennungen über die klassischen Bedingungen ,,125 × 4 mm, C18, 5 mm, 1 ml/min" nach, denn: Small ist wirklich beautiful – zumindest in der HPLC!
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