HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Trennung von sauren Komponenten mittels RP-HPLC

von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Die Trennung von basischen ist ein viel, viel schwierigeres Unterfangen als die Trennung von sauren Komponenten. Letzteres Trennproblem ist – stark vereinfacht formuliert – fast ein Kinderspiel. Wie geht nun das „Spiel“?

Die Lösung

Wir unterhalten uns zunächst über den Eluenten: Der wichtigste Faktor ist mit Abstand der pH-Wert, je nach Stärke der zu trennenden Säuren sollte er sich zwischen ca. 1,5 und 4,0 bewegen. Mit seiner Hilfe können die sauren Komponenten neutralisiert werden, oder allgemein formuliert, deren Ionisierungszustand und damit die Wechselwirkung mit der stationären Phase beeinflusst werden. Der Einsatz von Puffern ist grundsätzlich nicht verkehrt, doch ist dies erst ab einem pH-Wert von ca. 3...3,5 wirklich notwendig. Merke: Häufig ist die Peakform bei Verwendung lediglich einer Säure zur Einstellung des pH-Wertes besser, als wenn der entsprechende Puffer verwendet wird. Der pH-Wert soll mit dem Ziel einer maximalen Selektivität zu Beginn um ca. 0,5, später für die Feinjustierung um ca. 0,2 pH-Einheiten nach oben/nach unten variiert werden. Sind die pKs-Werte der Komponenten bekannt (Bemerkung: Ich würde wärmstens Software-Programme wie beispielsweise ACD empfehlen, die aus der Substanzstruktur den pKs-Wert ausrechnen), so kann hier gezielt bezüglich Selektivitäts-/Robustheitsexperimenten angesetzt werden. Als Säuren zur Einstellung des pH-Wertes im Eluenten kommen an erster Stelle folgende in Frage: Trifluoressigsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Ameisensäure und an zweiter Stelle: Perchlorsäure, Methansulfonsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure. Es hat sich gezeigt, dass häufig die Peakform nicht nur vom pH-Wert, sondern auch von der verwendeten Säure stark abhängt. Es lohnt sich demnach, schon bei einer zufriedenstellenden Selektivität, aber mäßigen Peakform nach Alternativen zu suchen.

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Werfen wir jetzt einen Blick auf die Säule: Liegen die Säuren undissoziiert vor (denken Sie an den pKs-Wert!), d.h. verhalten sie sich wie neutrale Moleküle, kommen hydrophobe, gut abgedeckte Phasen in Frage, zum Beispiel YMC Pro C18, Luna 2, Symmetry, Reprosil PUR, Nucleodur GRAVITY usw. Liegen die Säuren ionisch vor, so eignen sich für ihre Trennung eher polare Phasen, zum Beispiel LiChrospher, Hypersil ODS, Discovery Amid C16, Zorbax SB C8 usw. Wird „richtig“ sauer gearbeitet, so um pH-Wert 1,5, sollte man nicht-endcappte oder Spezial-Säulen wie Zorbax SB verwenden. Ihre Lebensdauer ist im stark Sauren wesentlich besser als die von endcappten, hydrophoben Phasen – letztere „bluten“ recht schnell, d.h. konkret, sie verlieren ihre Methylgruppe, die beim Endcapping an den Rest-Silanolgruppen entstand. Starke Säuren, die im für die HPLC-üblichen pH-WertBereich nicht zu neutralisieren sind, können mit Hilfe von Ionenpaarreagenzien wie Tetrabutylammoniumchlorid oder Tetrabutylhydrogensulfat maskiert werden, damit sie nun in quasi neutraler Form mit der hydrophoben C18-Oberfläche wechselwirken können.

Das Fazit

Manipulieren des pH-Wertes und Variieren der verwendeten Säure/des Ionenpaarreagenzes dürften die wichtigsten Optimierungsparameter bei der Trennung von sauren Komponenten mittels RP-HPLC sein.© by Stavros Kromidas

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