Labo Online - Analytic, Labortechnik, Life Sciences

HPLC-TippDer HPLC-Tipp

Unterschiede von HPLC- und UPLC/UHPLC-Trennungen

sep
sep
sep
sep

Der Fall
Seit einigen Jahren existieren bereits auf dem Markt Systeme, die Trennungen bei Drücken von bis zu 1000 bar erlauben (z.B. Jasco, Waters, Knauer). Man könnte nun vereinfacht annehmen, es handele sich dabei um „normale“ HPLC-Geräte, die lediglich so konzipiert sind, dass sie eben solche hohe Drücke ermöglichen. Das Ergebnis lautet: Merkliche Reduktion der Analysenzeit und des Lösungsmittelverbrauchs sowie – wegen der kleinen verwendeten Teilchen und der damit verbundenen hohen Bodenzahlen – Verbesserung der Auflösung. Zweifelsohne sind dies aus Anwendersicht die wichtigsten Unterschiede/Vorteile gegenüber klassischen HPLC-Trennungen. Beim Methodentransfer jedoch von HPLC- auf UPLC-Trennungen sollte man auch an manch eine Besonderheit der UPLC denken. Damit meine ich nicht bekannte Tatsachen wie peinliche Vermeidung von apparativen Totvolumina, Einsetzen von sehr reinen Chemikalien, die Verwendung von bestimmten Vials (z.B. Glas von Schott 3.00) oder die „richtige“ Einstellung von Datenaufnahme- und Integrationsparametern usw. Was wäre noch zu beachten?

Die Lösung
In der HPLC gilt generell Folgendes: Während der Trennung herrscht in der Säule ein Druckabfall vom Säulenanfang zum Säulenende. Das bedeutet, wir haben einen abfallenden Druckgradienten und einen ansteigenden Temperaturgradienten in axialer Richtung durch die frei gewordene Wärme, die vom Eluenten durch die Säule transportiert wird. Am Säulenkopf ist die erzeugte Wärme größer als am Säulenausgang, was eine ebenso erhöhte Temperaturdifferenz zwischen den zwei Säulenenden bedeutet, vor allem, wenn die Säule bei niedrigeren Temperaturen als bei ca. 50 °C betrieben wird.

Anzeige

Halten wir also fest: Es herrscht in Richtung Säulenausgang ein (konvexer) Druck-, Viskositäts- und Dichtegeradient und ein umgekehrter Temperaturgradient. Bei der UPLC nun sind diese Differenzen aufgrund des doch sehr hohen Eingangsdruckes von ca. 1000 bar nicht ohne Einfluss. Was ist das Ergebnis?

  • Durch den Temperaturgradienten vom Säulenkopf zum Säulenende haben wir eine gleichzeitige Abnahme des Retentionsfaktors, d.h. eine zunehmende Abnahme der Retentionszeit von später eluierenden Peaks. Dadurch ändert sich die Auflösung, mal positiv, mal negativ. Wenn beispielsweise im vorderen Teil des Chromatogramms viele polare Komponenten eluieren, wird deren Auflösung womöglich verbessert, andererseits können solche Peaks von nachfolgenden Peaks, die nun schneller nach vorne wandern, schlechter abgetrennt werden.
  • Änderung der Bodenzahl.
  • Änderung der relativen Retention.
  • Änderung der UV-Absorption, da deren Temperaturabhängigkeit von Analyt zu Analyt unterschiedlich sein kann.


Das Fazit
Durch den hohen Druck und den damit weiter oben beschriebenen Effekten in der UPLC kann es zu Folgendem kommen: Beim Methodentransfer einer HPLC-Methode auf die UPLC könnten die Ergebnisse im „hinteren“ Teil des Chromatogramms schlechter übereinstimmen als bei sehr frühen Peaks. Das kann die Peakform, die Retentionszeit, die Auflösung, aber auch die Peakfläche betreffen. Es liegt auf der Hand, dass solche Probleme bei sehr hohen Drücken zu befürchten sind. Wird eine UPLC-Anlage (aber auch UHPLC, Fast LC usw.) jedoch „nur“ bei 400…600 bar betrieben, machen sich die hier besprochenen Phänomene weniger bemerkbar.


© by Stavros Kromidas

Anzeige
Diesen Artikel …
sep
sep
sep
sep
sep

Weitere Beiträge in dieser Rubrik

Der HPLC-Tipp: LC/MS-Kontaminationen: DMSO aus der Transfer-Kapillare

Der HPLC-TippLC/MS-Kontaminationen: DMSO aus der Transfer-Kapillare

Die LC/MS-Kopplung hält immer schneller Einzug in viele Labors. Diesmal geht Klaus Illig auf tägliche Probleme ein und zeigt Lösungen auf.

…mehr

HPLC-TippSehr kleine Peaks – was kann ich tun?

Nehmen wir an, Sie müssen Komponenten in einer extrem geringen Konzentration quantifizieren – die Peaks sind einfach sehr klein. Es geht also im vorliegenden Fall vordergründlich nicht um eine gute Auflösung, es geht um eine gute Detektierbarkeit.

…mehr
HPLC-Tipp: Welchen Detektor soll ich verwenden?

HPLC-TippWelchen Detektor soll ich verwenden?

Welchen Detektor soll ich verwenden? Die Frage ist trivial und schwer zugleich.

…mehr
Dynamische Mischkammer mit Magnetrührstäbchen

HPLC-TippGeisterpeaks durch Rückstände in der Mischkammer

In einer von mehreren Benutzern abwechselnd gefahrenen HPLC-Gradientenanlage treten immer wieder unerklärliche Störungen im Chromatogramm auf, die auch durch intensives Spülen nicht zu beseitigen sind.

…mehr

HPLC-TippAnalytischer Methodentransfer von HPLC-Methoden – Teil 3

Im zweiten Teil der Kleinen-Tipps-Serie zum Methodentransfer von HPLC-Methoden hat Mike Hillebrand auf fehlende Infos beim Methodentransfer hingewiesen. Fehlende Infos dürften in der Tat eine der häufigsten Ursachen für missglückte Methodentransfers sein. Im dritten und letzten Tipp zu diesem Thema greife ich daher diese Problematik erneut auf.

…mehr
Anzeige
Anzeige

Bildergalerien bei LABO online

Anzeige

Nichts mehr verpassen!

LABO Newsletter abonnieren

Der kostenlose LABO Newsletter informiert Sie über neue Produkte, Lösungen, Technologietrends und Innovationen aus der Branche sowie Unternehmensnachrichten und Personalmeldungen.

Anzeige
Anzeige

Mediaberatung