HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

LC-MS-Kopplung – Matrix-Einfluss, das Problem der Empfindlichkeit

von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Die LC-MS-Kopplung wird naturgemäß – abgesehen von Spezialfällen wie beispielsweise LC-MS als „Peakseparator“ für Fraktionierungen in der präparativen HPLC – zur Überprüfung der Peakhomogenität und zur Substanzidentifizierung eingesetzt. Dies geschieht häufig im Spurenbereich, zum Beispiel Zersetzungs- und Nebenprodukte, Metabolite, unbekannte Verunreinigungen. In solchen Fällen gilt, jeglichen Verlust an Empfindlichkeit zu vermeiden. Welche Möglichkeiten gibt es nun dafür?

Die Lösung

Nachfolgend sind einige Hinweise stichwortartig aufgelistet.

Matrix:

•Überprüfen Sie eine eventuelle Ionisationsunterdrückung durch die Matrix: Eine Standardlösung wird mit Hilfe einer zweiten Pumpe und eines T-Stückes dem Eluenten nach der Säule zudosiert. Nachdem die Basislinie konstant ist, wird eine Plazebo/Matrix-Lösung injiziert. An der Totzeit (oder später) erscheint womöglich ein negatives Signal, das die Ionisationsunterdrückung durch Matrix-Bestandteile dar­gestellt. Je nach Matrix kann das negative Signal lediglich ein negativer Peak oder aber auch ein „Buckel“ sein, der u.U. eine halbe Minute lang ist. Sie sollten nun die chromatographischen Bedingungen so wählen, dass die interessierenden Peaks nach dieser Zeit eluieren.

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•Entfernen Sie bei Bedarf die Matrix durch Mikro-Flüssig-Flüssig-Extraktion bzw. bei größeren Volumina via SPE.

•Verwenden Sie für die Methodenentwicklung unbedingt reale Proben!

Modus:

Arbeiten sie im MS-MS-Modus nur, wenn unbedingt erforderlich, denn: Die nochmalige Fragmentierung führt zu einem Empfindlichkeitsverlust um ca. Faktor 10.

Chemikalien:

TFA: TFA führt zur Ionisationsunterdrückung, verwenden Sie im Spurenbereich Alternativen wie Ameisensäure, Perchlorsäure.

„Dopant“: Verwenden Sie zur Erhöhung der Ionisation bei APPI 1...5 % Toluol oder Aceton als Protonendonatoren („Dopant“).

Das Fazit

Jegliche Ionisationsunterdrückung bei Bestimmungen im Spurenbereich, gleich zu setzen mit Empfindlichkeitsverlust, soll unbedingt vermieden werden. Die Mittel lauten: Matrixentfernung, Einsatz von „richtigen“ Chemikalien und Erhöhung der Ionisation.©by Stavros Kromidas

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