Der HPLC-Tipp im November

Peaks auf einer Flanke - mögliche Konsequenzen und Maßnahmen

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Zur Richtigkeit einer Bestimmung abhängig vom Gradientenprofil, Details siehe Text.

Manch ein Peak eluiert auf einer Flanke. Die Flanke kann u.a. ein abfallender Gradient, ein sehr langsam eluierender Peak oder einfach Matrix sein. Angenommen, das Problem ist chromatographisch nicht zu lösen, wie könnte man vorgehen, um den Fehler bei der Bestimmung der Peakfläche zu minimieren?

Die Lösung

Im Falle vom Gradienten haben wir an dieser Stelle bereits darüber gesprochen, wie eine Lösung aussehen könnte: Blindgradient bzw. das Chromatogramm einer Matrixinjektion (Matrixlösung ohne Probe) vom Original-Chromatogramm abziehen und das Differenz-Chromatogramm integrieren. Heute möchte ich kurz auf zwei etwas anders gelagerte Fälle eingehen.

Fall 1:

In Bild 1 sind sechs Chromatogramme dargestellt.

Hier handelt es sich um die Bestimmung einer Komponente, die sich an der Flanke der miteluierenden Matrix befindet. Bei den ersten drei Chromatogrammen handelt es sich um lineare Gradienten bei drei Wellenlängen (1: 300 nm, 2: 250 nm, 3: 200 nm). Es liegt auf der Hand, dass die Messung bei 250 nm (Chromatogramm 2) die bessere Lösung darstellt, die leichte Drift könnte dennoch zu einer etwas fehlerhaften Integration führen. Im unteren Teil von Bild 1 handelt es sich um die gleiche Probe, allerdings wurde hier ein konkaves Profil beim Gradienten gewählt. Dadurch, dass der Peak jetzt später – praktisch auf einer idealen Basislinie – eluiert, dürfte die Integration recht unproblematisch sein.

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Fall 2:

In Bild 2 sind ebenfalls sechs Chromatogramme zu sehen.

In diesem Fall handelt es sich um die Bestimmung eines interessierenden Peaks in einer sehr „unangenehmen“ Matrix. Die Matrix erscheint als ein verschmierter Peak, der sehr langsam von der Säule eluiert. Dieses Bild ist stellvertretend für mehrere Fälle von verschmierten Peaks, z.B: Starke Basen an silanophilen Phasen, Proteine an langkettigen Alkylphasen, „schwierige“ Matrices wie Öl, Fette, Huminsäuren etc. Wenn nun die ursprüngliche Methode gefahren wird, ergibt sich das Chromatogramm im oberen Bild von Bild 2, gezeigt wird jenes bei drei Wellenlängen (1: 300 nm, 2: 250 nm, 3: 200 nm). Auch hier liegt es auf der Hand, dass die Messung bei 250 nm (Chromatogramm 2) die bessere Lösung darstellt: Wenn man bei 250 nm arbeiten würde, käme man nicht auf die Idee, dass hier ein Problem vorliegt. Ein Blick jedoch auf die Chromatogramme bei 200 nm und 300 nm (1 und 3) offenbart, dass der Peak auf der Flanke der eluierenden Matrix „sitzt“ und auf ihr transportiert wird. Nehmen wir an, man verwendet jetzt zum Spülen zwischendurch eine stärkere Lösung, damit die Matrix schneller von der Säule eluiert – z. B. mehr ACN oder THF (siehe 3 untere Chromatogramme von Bild 2). Die Substanz „gleitet“ jetzt auf einer höheren Konzentration von Matrix-Molekülen, Ergebnis: Eine etwas andere Retentionszeit (3, 77 min vs. 3, 66 min) und Unterbefund bei der Peakfläche.

Das Fazit

Zum Fall 1: Es gibt selten Vorteile, die für eine Verwendung von konvexen/konkaven Gradientenprofilen sprechen. Neben einer gezielten Verbesserung der Nachweisgrenze in einem bestimmten Bereich des Gradienten wäre der hier besprochene Fall eine zweite Ausnahme.

Zum Fall 2: Wenn Sie kleine Verschiebungen der Retentionszeit und/oder Probleme mit der Reproduzierbarkeit der Peakfläche haben: Überlegen Sie, ob Sie durch Veränderung Ihrer Spülpraxis oder Veränderung der Gradientensteilheit nicht ungewollt dafür sorgen, dass ein/mehrere Peaks auf einer Flanke eluieren. Dazu hilft das Anschauen des Chromatogramms bei einer um ca. 50 nm niedrigeren bzw. höheren Wellenlänge.

© by Stavros Kromidas

http://www.kromidas.de

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