Der HPLC-Tipp im Juni

Säule umdrehen - wirklich sinnvoll?

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken
Säule umdrehen – wirklich sinnvoll?

Verbesserung der Peakform durch Umdrehen der Säule (Erläuterungen siehe Text).


Bekanntlich befindet sich auf den Säulen ein Pfeil, folglich kann die Säule in Pfeilrichtung richtig eingebaut werden. Wenn ich nun in meinen Seminaren empfehle, bei Bedarf die Säule umzudrehen, ernte ich vielfach misstrauische Blicke; das ist bei weniger erfahrenen Kolleginnen und Kollegen völlig verständlich. Also direkt die Frage: Kann/sollte man die Säule umdrehen?


Die Lösung

Um gleich noch vor der Erklärung eine Antwort zu geben: Ja, bis auf eine Ausnahme eindeutig ja! Diese Maßnahme kann nämlich mit zwei positiven Aspekten in Verbindung gebracht werden:

1. Während des Einsatzes der Säule kann sich mit der Zeit am Säulenkopf einiges an „Dreck“ sammeln. So weit, so gut. Wenn jetzt die Säule gespült wird, werden die Verunreinigungen erst über die ganze Säule gespült, um diese dann zu verlassen. Wird die Säule dagegen umgedreht, werden die Verunreinigungen logischerweise im Nu herunter gespült. So geht das Ganze schneller und das Spülen erweist sich auch als gründlicher.

2. Die Säule stellt für den Fluss den größten Widerstand dar, ca. 80…90 % des Druckes, der in der HPLC aufgebaut wird, wird durch die Säule verursacht, den Rest machen die Kapillaren, etc. aus. Des Weiteren ist es so, dass der Säulenkopf das Meiste „abkriegt“. Das bedeutet wiederum, die mit der Zeit entstehenden Totvolumina und Kanäle befinden sich vorwiegend am Säulenkopf. Halten wir dies fest, denn wir kommen gleich darauf zurück.

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In der HPLC haben wir es mit einem mehr oder weniger starken Verdünnungseffekt zu tun, d.h. das Volumen, in dem meine Substanz am Detektor ankommt (Peakvolumen), ist wesentlich größer als das Injektionsvolumen – je größer das Peakvolumen, um so breiter der Peak. Als Faustregel gilt ein Verdünnungsfaktor von ca. 10. Jetzt machen wir folgendes Gedankenexperiment: Wir injizieren 10 µl. (Bemerkung: Aufgrund des Volumens vom Autosampler bis zur Säule sowie der teilweise herrschenden laminaren Strömung wird die Probenlösung bis zum Eintritt in die Säule je nach Hardware merklich/weniger merklich verdünnt, der Einfachheit halber lassen wir dies hier jedoch unberücksichtigt.) Nehmen wir ferner an, am Säulenkopf befindet sich ein Totvolumen von 5 µl, d.h. die Probenmoleküle befinden sich direkt nach dem Eintritt in die Säule in einem Volumen von 15 µl. Nun fangen die Wechselwirkungen an, die Verdünnung setzt ein und am Säulenende kommen ca. 150 µl an. Jetzt drehen wir die Säule um, das Totvolumen von 5 µl befindet sich am Säulenende, also zur Detektorseite hin. Aus 10 µl werden in diesem Fall am Säulenende 100 µl plus die 5 µl des sich dort befindenden Totvolumens, die Probenmoleküle sind nun in 105 µl gelöst, Ergebnis: Kleineres Peakvolumen, bessere Peakform (siehe Bild): Unteres Chromatogramm: „Alte“ Säule, ein Totvolumen am Säulenkopf verursacht Doppelpeaks. Oberes Chromatogramm: Gleiche Säule umgedreht und erneut injiziert: Die Peaks sind bei weitem nicht ideal, eine Verbesserung ist jedoch erkennbar.

Die Erfahrung lehrt, dass die Chancen für eine Verbesserung der Peakform bei ca. 50 % liegen. Weiterhin liegt es auf der Hand, dass je später die Peaks eluieren, umso unwichtiger Totvolumina in der Säule sind – die Peaks sind eh recht breit…

Je kleiner dagegen das Peakvolumen (kurze, dünne Säulen, ≤ 3…2-µm-Teilchen, frühe, schmale Peaks), umso eher machen sich Totvolumina in der Säule bemerkbar, bei isokratischen Trennungen eher als bei Gradiententrennungen.

Wann sollte man nun mit dem Umdrehen vorsichtig sein? Etwas problematisch erweisen sich Affinitätsmedien, Ionenaustauscher, Gelfiltrationssäulen und chirale Säulen – aber mein Gott: Ich denke, man kann´s ruhig auch hier tun, die Säule ist sowieso „hin“… Es gibt einen einzigen Fall, da ist es wirklich tabu: Bei den meisten UHPLC-Säulen ist die Porengröße der Metallfritte am Säulenkopf größer als am Säulenende. Wenn die Säule umgedreht wird, kann stationäre Phase austreten!

Übrigens: Wenn die Säule umgedreht wird, kann sie völlig normal für die Trennung genutzt werden. Das „Spielchen“ kann man häufig betreiben, bis irgendwann natürlich eine neue Säule benötigt wird.


Das Fazit

Eluieren alle Peaks in Ihrem Chromatogramm (vorne häufig schlimmer als hinten) als Doppelpeaks, mit einem starken Tailing oder einem leichten Fronting, kann dies ein Hinweis für Totvolumina und/oder eine stark kontaminierte Fritte sein. Eine pragmatische, schnelle Maßnahme stellt das Umdrehen der Säule dar. Das hilft sicherlich nicht immer und auch nicht ewig, dennoch ist es ein Versuch wert.

© by Stavros Kromidas

www.kromidas.de

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