Schnellexperimente zur Verbesserung der Peakform und/oder der Auflösung

Der Fall
Sie befinden sich gegen Ende Ihrer Optimierungsbemühungen: Sie haben eine neue Methode entwickelt oder eine bestehende verbessert.

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HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp im September

Schnellexperimente zur Verbesserung der Peakform und/oder der Auflösung

von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall
Sie befinden sich gegen Ende Ihrer Optimierungsbemühungen: Sie haben eine neue Methode entwickelt oder eine bestehende verbessert. Das Ganze sieht recht vernünftig aus, aber zwei oder drei Peaks sind nicht optimal abgetrennt oder eine mögliche Verunreinigung erscheint am Hauptpeak als Buckel. Sie haben eigentlich keine Lust mehr, und/oder auch keine Nerven, und/oder keine Zeit, großartig weitere aufwendige Sachen zu testen. Sie sind also bestenfalls bereit, sagen wir, ungefähr noch einen Tag für dieses Trennproblem zu investieren. Dann sollte aber Schluss sein. Welche relativ einfachen Dinge könnte man in diesem Fall ausprobieren, die vielleicht etwas „bringen“ könnten?
Die Lösung
Es folgen Tipps und Tricks in kompakter Form und mit knappen Erläuterungen. Schauen Sie, welche davon bei Ihnen mit einem vertretbaren Aufwand realisierbar sind. Sollten Sie dazu Fragen haben, können Sie mich gerne kontaktieren.

Vorbemerkung: Ich unterstelle, dass Sie im Falle von frühen Peaks und Verwendung von kurzen, dünnen Säulen und Teilchen kleiner 3 µm optimale Aufnahmeparameter eingestellt haben: Zeitkonstante (Response Time, Rise Time) 0,1 s, Sample Rate 10 Hz, Bandwidth 16 nm. Desweiteren, dass die ersten interessierenden Peaks frühestens nach etwa der 3- bis 4-fachen Totzeit eluieren (ausreichend starke Wechselwirkungen). Sind diese zwei Grundvoraussetzungen nicht gegeben, besteht Ihrerseits noch ein kleiner Handlungsbedarf…

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Jetzt geht´s los.

Verfügen Sie über eine UHPLC-Anlage? Falls ja:

1. Probieren Sie eine 250 mm, 2,1 mm, 2-µm-Säule bei 10…15 °C und auch bei 50 °C aus. Bei der niedrigen Temperatur erhöhen Sie – bei einer genügend großen Bodenzahl und einer guten Empfindlichkeit – die Selektivität, bei der hohen Temperatur erhöhen Sie noch mehr die Bodenzahl, beides kann zu einer Verbesserung der Auflösung führen, je nach Mechanismus eben auf dem einen oder dem anderen Weg.

2. Bauen Sie nach Ihrer Säule – falls es eine mit einem ausgeprägt polaren Charakter ist – eine dünne Kapillare und/oder ein Verbindungsstück als Restriktor ein und versuchen Sie dadurch einen zusätzlichen Druckabfall von ca. 150…250 bar zu erzeugen, denn: Bei der Trennung von polaren Analyten, Isomeren etc. könnte der erhöhte Druck zu einer Änderung – hoffen wir hier Verbesserung – der Selektivität führen.

Falls nein, d.h. Sie verfügen über eine klassische HPLC-Anlage:
Säule: Wenn Sie Moleküle mit polaren funktionellen Gruppen, Steroide, Isomere, Flavonoide, Carotinoide usw. trennen wollen: Verwenden Sie – falls noch nicht geschehen – eine stationäre Phase mit irgendeinem Ring als funktionelle Gruppe, am besten zusätzlich mit weiteren polaren Gruppen an der Oberfläche, z.B. Pentafluorphenyl, Biphenyl, Phenyl-Hexyl, C30 plus hydrophil endcapped, PEG. Alternativ: Bauen Sie eine dieser Phasen als Vorsäule zu Ihrer üblichen C18-Säule ein. Es versteht sich von selbst dass in solchen Fällen Methanol (relativ polares Lösungsmittel, Entstehung von Methanolaten und Verstärkung von polaren Wechselwirkungen) häufiger die bessere Alternative ist im Vergleich zu Acetonitril. Merke: Je ähnlicher die „Chemie“ der zu trennenden Moleküle ist, umso notwendiger sind (zusätzliche) polare Wechselwirkungen. Letztere erweisen sich auch bei der Trennung von Molekülen mit ähnlicher „Chemie“, aber mit Unterschieden in der Anordnung von Gruppen als hilfreich: Geometrische Isomere, α-β-Isomere, Doppelbindungsisomere usw.

Wenn Sie ein experimentierfreudiger Mensch sind und darüber hinaus sich leisten können, eine alte Säule zu „opfern“: Belegen Sie eine „alte“ C18-Säule – am besten eine LiChrospher C18, Hypersil ODS, LiChrospher Select B oder Spherisorb – oder eine Kieselgelsäule mit Ag+- oder Cu2+-Ionen, indem Sie einfach mit Hilfe der Pumpe eine AgCl- oder CuSO4-Lösung über die Säule schicken. Nach dem Spülen schalten Sie nun die so präparierte Säule nach Ihrer C18-Säule in Serie. Es kann sein, dass die Selektivität durch zusätzliche Komplexbildung Ihrer Moleküle mit den sich in der Kieselgelmatrix nun befindenden Kationen verbessert wird.
Temperatur: Fahren Sie einen Lauf bei 10…15 °C. Wenn Sie wollen – im Falle von Gradienten – bei zusätzlicher Erhöhung des Flusses und konstanter Gradientendauer (Erhöhung des Gradientenvolumens bei gleichzeitiger Erhöhung der Selektivität).
Autosampler: Füllen Sie Ihre Autosampler-Schleife mit Wasser. Anschließend injizieren Sie wie gehabt. Ihre Probenlösung verdrängt jetzt ein Teil des Wassers und kommt in „viel“ Wasser gelöst am Säulenkopf an. Durch das schwache Lösungsmittel „Wasser“ erreichen Sie nun eine Anreicherung/Fokusierung der Substanzzone am Säulenkopf und dadurch eine Verbesserung der Peakform.

Es ist klar, dass auch UHPLC-Anwender solche irdische Sachen ausprobieren können…

Das Fazit
Oben genannte Maßnahmen können, wenn man Glück hat, zu interessanten Erkenntnissen/Rückschlüssen über Formulierung, Metabolismus, Stabilität, Produktion etc. führen. Noch einmal: Diese Vorschläge sind geeignet, um in kritischen, schwierigen Fällen die Peakhomogenität zu überprüfen bzw. um die Trennung zu verbessern. Ein Teil dieser Maßnahmen ist sicherlich nicht für den Routinebetrieb gedacht!

© by Stavros Kromidas
www.kromidas.de

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