HPLC-Tipp

Totzeit, Totvolumen, Verweilvolumen

Der Fall

Wir haben uns an dieser Stelle bereits über die Bedeutung dieser Begriffe sowie deren Einfluss auf die Trennung unterhalten, nur: In meinen Seminaren stelle ich häufig fest, dass diese Größen uneinheitlich, teilweise auch falsch, benutzt werden. Auch ihr Einfluss auf die Trennung wird unter- oder überschätzt. Lasst uns diese Dinge noch einmal definieren, die "alten" Leser mögen mir diese Wiederholung nachsehen.

Die Lösung

Vorbemerkung: Aus praktischer Sicht gilt natürlich Folgendes: Wenn diese Begriffe anders als hier definiert, benutzt werden und alle Beteiligten das gleiche darunter verstehen, gibt es selbstverständlich absolut keinen Handlungsbedarf.

Totzeit oder Mobilzeit ("dead time", "mobile time")
Das ist die Verweildauer aller Komponenten im Eluenten; sie ist identisch mit der Zeit einer inerten Komponente von der Injektion bis sie den Detektor erreicht. Als inert wird eine Komponente bezeichnet, die in jede Pore der Teilchen der stationären Phase hinein diffundiert, aber nicht festgehalten wird - jene Substanz geht keinerlei Wechselwirkungen mit den funktionellen Gruppen der stationären Phase ein. Merke: Weiter oben steht deswegen "im Eluenten", weil auch die Poren der Teilchen mit der mobilen Phase gefüllt sind. Die Totzeit ("Front", "Injektionspeak") ist oft - vor allem bei niedrigen Wellenlängen - als kleiner positiver oder negativer oder positiver plus negativer Peak oder lediglich als Basislinien-Störung zu sehen. Die Totzeit wird ausschließlich von physikalischen Parametern beeinflusst, wie Länge der Säule, Innendurchmesser, Flussrate, Packungsdichte. Das bedeutet, wenn Sie keine längere/kürzere/dünnere Säule eingesetzt haben und feststellen, dass die Totzeit sich geändert hat, dann kann sich nur der Fluss geändert haben, z.B. Luft in der Pumpe oder Leckage. Es liegt auf der Hand, dass Peaks auch vor der Totzeit eluieren können. Das sind Substanzen, die aus zwei Gründen nicht in die Poren hinein diffundieren: Entweder sind sie viel zu groß wie Polymere (Größenausschluss) oder sie sind zwar klein, aber sehr stark ionisch und werden daher von den Silanolgruppen regelrecht abgestoßen (Ionenausschluss).

Als Beispiele wären hier Phthalsäure, Acetate, Terephthalate und Hydrochloride zu nennen.

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Totvolumen("dead volume", "extra column effects")
Das ist das Volumen der Apparatur vom Autosampler bis einschließlich Detektor μ ohne Säule! Das wäre z.B. das Volumen der Verbindungskapillaren, das Volumen zwischen den Fittings/Verbindungsstücken sowie der Detektorzelle. Dieses Volumen beeinflusst in der klassischen HPLC und bei üblichen Bedingungen die Retentionszeit nur minimal. Jenes kann jedoch die Peakform merklich beeinflussen, speziell bei frühen, kleinen Peaks. Die Folge ist Tailing. Zahlenbeispiel: Durch Unachtsamkeit (dicke Kapillare, "schlechte" Verbindungen) entsteht ein zusätzliches Volumen von 50 μl, der Fluss sei 1 ml/min. Was macht das aus? Volumen ist Fluss x Zeit, Zeit ist Volumen durch Fluss, hier:
t = V/F, 50 μl/1000 μl/min.
Durch das zusätzliche Totvolumen von 50 μl ergibt sich eine Verschiebung der Retentionszeit um 3 s, bei 0,5 ml/min wären es 6 s. Das ist nicht tragisch. Eluieren allerdings Peaks innerhalb eines Bereichs von ca. 2 ... 4 Mal x Totzeit wird womöglich ein merkliches merkliches Tailing beobachtet. Merke: Je kleiner das Säulenvolumen (das sind Säulen mit Dimensionen gleich/kleiner ca. 100 mm, 3 mm, 3 μm) umso dramatischer wird diese Peakformverschlechterung und folglich die Nachweisgrenze/Auflösung. Dies betrifft allerdings nur isokratische Trennungen, bei Gradienten ergeben sich auch trotz Totvolumina in der Regel symmetrische Peaks.

Verweil- oder Verzögerungsvolumen ("dwell volume", "delay volume")
Dieses Volumen ist wichtig im Falle von Gradientenläufen: Das ist das Volumen vom Ort der Mischung der zwei oder drei Eluenten bis zum Säulenkopf, also das Volumen von Mischkammer bis Säule. Dieses kann abhängig vom Gerätedesign - Hoch-/Niederdruckgradient, Geometrie und Volumen des Mischventils, Volumen der Autosampler-Schleife - recht unterschiedlich sein, Ergebnis: Es können sich bei Methodentransfers von lediglich kleinen Verschiebung der Retentionszeit bis hin zur Änderung der Selektivität, der Peakform, der Elutionsreihenfolge oder der Auflösung ergeben. Das ist wahrlich eines der größten Probleme beim Methodentransfer! Auch hier gilt: Je kleiner das Säulenvolumen, umso größer können besprochenen Änderungen sein.

Das Fazit

Viele Anwender arbeiten im Gradienten-Modus. Für sie ist das Verweilvolumen sicherlich die interessanteste bzw. die kritische Größe. So sollte der Einfluss der Hardware auf das Ergebnis - auch und gerade abhängig von den Säulendimensionen - im Rahmen der Validierung überprüft werden, auch bei Methodentransfers kommt ihm eine entscheidende Bedeutung zu.


Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

www.kromidas.de

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