Dispensiersystem sciFLEXARRAYER

Diagnostika basierend auf Autoantikörpersignaturen

Aussagekräftige Biomarker als Zukunftstrend in der In-vitro-Diagnostik
Bild 3: Die Qualität der Proteine wird bei Protagen routinemäßig mittels Massenspektrometrie überprüft.

Dr. Stefan Müllner*, Dr. Holger Eickhoff**, Almut Gebhard**, Katrin Welzel**)

Eine genaue Diagnose ist Voraussetzung für die richtige Therapieentscheidung. Und: Je früher und je präziser die Diagnose erfolgen kann, desto größer die Aussicht auf den Therapieerfolg. Eindrückliches Beispiel sind die Überlebensraten von Krebspatienten, die eindeutig mit dem Zeitpunkt der Erkennung des Krebsstadiums korrelieren. Der Bedarf an schnelleren und verlässlicheren diagnostischen Tests ist insbesondere im Hinblick auf die Entwicklungen in der Personalisierten Medizin sehr hoch. Der folgende Beitrag fokussiert sich auf die Entwicklung und den Einsatz von Protein-Microarrays, die in Zukunft Therapieauswahl und Patientenstratifikation erleichtern werden – veranschaulicht an den Indikationen Prostatakrebs und Multiple Sklerose.
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Identifizierung und Einsatz von Biomarkern charakterisieren einen zentralen Zukunftstrend der medizinischen Forschung. Laut einer 2010 veröffentlichten Marktstudie von Business Insights Ltd. ist die Anzahl an klinischen Studien unter Einsatz von Biomarkern in den letzten Jahren um das Zehnfache gestiegen. Dabei unterscheidet man Stratifizierungsmarker (bessere Auswahl der Studienkohorte) und Biomarker zum Therapiemonitoring. Die dynamisch wachsenden Erkenntnisse der Molekularbiologie haben in den vergangenen Jahren dazu geführt, dass eine Vielzahl DNA-basierter Tests entstanden ist und dieser Trend setzt sich weiter fort. Tatsächlich sind es aber die Proteine, welche die biologischen Funktionen im Körper ausüben, und ihre Vielfalt sowie Komplexität übersteigt die der Gene bei weitem. Im Folgenden soll daher eine neue Technologieplattform zur Auswahl und zum Einsatz von Protein-Biomarkern vorgestellt werden.

Die Technologieplattform

Die Protagen AG, Dortmund, nutzt die proprietäre UNIarray-Plattform, um indikationsspezifische Autoantikörper-Signaturen im Blut festzustellen und auf dieser Basis diagnostische Tests zu entwickeln. Autoantikörper sind nicht etwa ausschließlich pathogenen Ursprungs, sondern bilden einen elementaren Bestandteil des Immunsystems. Daher können sie im Blut eines jeden, d.h. sowohl bei Kranken als auch bei Gesunden, auf Grund ihrer relativ hohen Konzentration und Stabilität sehr leicht nachgewiesen werden. Allerdings unterscheiden sich je nach Krankheit und Krankheitsstadium die Sequenz und Anzahl der korrespondierenden Antigene. Andererseits unterscheiden sich die Autoantikörper physikalisch praktisch nicht, so dass sich spezifische Signaturen mit herkömmlichen Technologien nicht bestimmen lassen. Bietet man nun aber eine möglichst große Menge an unterschiedlichen humanen Proteinen auf einer Oberfläche als „Köder“ an – UNIarray® nutzt hier circa 40 000 Bindungspartner – so lassen sich aus dem Blut die spezifischen Autoantikörper sehr einfach „herausfischen“. Indikationsspezifische Autoantikörper-Signaturen wurden bereits bei praktisch allen chronischen Erkrankungen nachgewiesen.

Die Nutzung des Nachweises von Autoantikörpern in Serum/Plasma bzw. Cerebrospinal-Flüssigkeit (CSF, Liquor) hat außerdem gegenüber anderen Biomarkern einige weitere Vorteile:

  • Nahezu unbegrenzte Haltbarkeit bei richtiger Lagerung aufgrund spezifischer Struktur und Stabilität von Antikörpern.
  • Nutzung sehr robuster und gut reproduzierbarer Technologien zum Nachweis und zur Quantifizierung, da Antikörper in ausreichender Konzentration in Serum/Plasma und CSF enthalten sind.
  • Eine Anreicherung oder komplizierte Probenvorbereitung ist nicht notwendig aufgrund ihrer spezifischen und hochaffinen Bindungsmöglichkeit an ihr korrespondierendes Autoantigen. Die Anreicherung erfolgt quasi während der Analyse durch Bindung an das korrespondierende Autoantigen.
  • Die Probennahme ist unabhängig von Tageszeit, Nahrungsaufnahme etc., da die Antikörperproduktion der B-Zellen keinem circardianen Rhythmus unterliegt.
  • Die Nutzung von Autoantikörpern in der Diagnostik hat das Potential zur Entwicklung von prognostischen Tests. Studien in den USA mit an Systemischem Lupus erythematodes erkrankten Patienten haben kürzlich nachgewiesen, dass bestimmte Autoantikörper schon 10 Jahre vor Krankheitsausbruch nachweisbar sind.

Die unter dem Begriff UNIarray zusammengefasste Technologieplattform von Protagen erlaubt nun sowohl die systematische Identifizierung und Validierung von indikationsspezifischen Biomarkern als auch die Herstellung und Nutzung von diagnostischen Produkten in Form von Protein-Microarrays. Protagen besitzt fünf gewebsspezifische Expressionsbibliotheken, welche in etwa 200 000 Klonen mehr als 40 000 Expressionsprodukte von circa 10 000 humanen Genen repräsentieren. Mit diesen putativen Autoantigenen kann die Interaktion von Immunglobulinen aus Patientenserum sehr schnell und sicher nachgewiesen werden. Zusammen mit akademischen Partnern wurden von Protagen bereits Protein-Biomarker für zahlreiche Indikationen, so etwa Multiple Sklerose, Rheumatoide Arthritis, Prostatakarzinom, Morbus Parkinson, Alzheimer, Systemischer Lupus, Alopecia areata und Dilatative Cardiomyopathie identifiziert und zum Patent angemeldet. Derzeit sind bei Protagen die Entwicklungsprogramme für die Indikationen Prostatakrebs und Multiple Sklerose am weitesten fortgeschritten.

Prostatakrebs-Diagnostik

Prostatakrebs ist mit 26 % mittlerweile die häufigste Krebserkrankung bei Männern und verursacht 10 % der Krebssterbefälle in Deutschland. Nach einer Schätzung des Robert-Koch-Instituts werden ab 2010 pro Jahr mehr als 64 300 neue Fälle diagnostiziert. Neben dem gesetzlichen Früherkennungsprogramm, das ab dem 45. Lebensjahr jährlich die Untersuchung der Geschlechtsorgane und eine Untersuchung der Prostata durch Tastbefund beinhaltet, ist der PSA-Test, eine immunologische Quantifizierung des „Prostata-spezifischen Antigens“ im Blut, sehr bekannt und verbreitet. Aufgrund der unzureichenden Sensitivität und Spezifität wird der PSA-Test jedoch nicht für die generelle Früherkennung in Deutschland empfohlen und daher die Kosten von den gesetzlichen Krankenkassen nicht erstattet. In den USA wird der PSA-Test ab dem Alter von 50 Jahren empfohlen. Wobei ein erhöhter PSA-Wert allerdings nicht mit einer Krebsdiagnose gleichzusetzen ist. Vielmehr gibt er einen Hinweis darauf, wann eine Biopsie angezeigt ist. Aber auch mit der Biopsie lässt sich Krebs nicht immer mit Sicherheit feststellen. Tragischer Weise kann dies erst nach der operativen Entfernung der Prostata festgestellt werden. Dies hat erhebliche Konsequenzen für die betroffenen Patienten. Daher ist der Bedarf nach einem sicheren diagnostischen Test für Früherkennung, Verlaufskontrolle und Nachsorge sehr hoch.

Das Ziel von Protagen ist gegenwärtig, das bereits identifizierte und verifizierte Panel von derzeit 408 Protein-Biomarkern auf seine Eignung zur Differenzierung zwischen gutartiger Prostata-Vergrößerung und Prostatakrebs im Rahmen einer klinischen Validierungsstudie mit 1000 Patientenproben zu überprüfen. Hierfür wurden internationale Partner aus den USA (Johns Hopkins University, Baltimore), Österreich (Medizinische Universität Innsbruck) und Deutschland (Universität Münster) gewonnen.

Diagnostik der Multiplen Sklerose

Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung, die mit einer Prävalenz von 1 : 1000 und einer Inzidenz von 7 : 100 000 in Mitteleuropa eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen ist. Die Erstmanifestation liegt überwiegend im jungen Erwachsenenalter. Allein in Deutschland sind ca. 130 000 Patienten, etwa 2/3 Frauen, von dieser Krankheit betroffen. Jährlich werden ca. 2500 Menschen neu mit MS diagnostiziert. MS ist zwar nicht heilbar, jedoch sind zahlreiche Therapiemöglichkeiten verfügbar, welche darauf abzielen, die größtmögliche Lebensqualität zu gewährleisten.

Die meisten der bekannten Anfangsbeschwerden können eventuell auch andere Ursachen haben. Es dauert deshalb oft Monate, zuweilen auch Jahre, bis die Diagnose eindeutig feststeht. Daher ist eine sichere Frühdiagnose entscheidend für Therapieauswahl und -beginn.

In Kooperation mit dem Klinikum Lüdenscheid, dem Karolinska Institut Stockholm, der TU München und dem Accelerated Cure Project, Waltham, USA, führt Protagen derzeit auch für diese Indikation eine klinische Validierungsstudie mit 1000 Patientenproben durch. Ziel ist es hier, durch intelligentes Studiendesign eine finale Auswahl von relevanten Markerproteinen für den ersten Serum-basierten diagnostischen Test für MS zu treffen. Das validierte Marker-Panel wird dann zu einem Testkit weiterentwickelt.

Diagnostische Protein-Microarrays

Im Unterschied zur Herstellung der längst etablierten DNA-Arrays erweist sich die Produktion von Protein-Arrays als diffiziler, denn Proteine umfassen eine heterogene Gruppe von Molekülen. Um eine möglichst uneingeschränkte Funktionsfähigkeit der Proteine auf einem Microarray zu erhalten, müssen zahlreiche Parameter wie Markierung, Pufferauswahl oder Waschprozeduren individuell angepasst werden. Neben der notwendigen Protokolletablierung und Laborautomatisierung sind schließlich für die angestrebte Zulassung eines diagnostischen Tests Präzision, Reproduzierbarkeit und Qualitätskontrolle entscheidende Kriterien, um eine gleichbleibend hohe statistische Sicherheit der diagnostischen Aussage zu gewährleisten. Die Scienion AG hat sich als Experte in diesem Bereich etabliert und bietet ein Technologieportfolio, das über ein Jahrzehnt konsequent ausgebaut wurde.

Protein-Arrays, insbesondere Hochdichte-Protein-Arrays, werden in der Regel mit „Kontaktverfahren“ produziert. Dabei taucht ein Stahlstift, der entweder massiv ausgeformt ist („solid pin“) oder als geschlitzter und nach dem Prinzip einer Füllerspitze arbeitender Stift („split pin“ oder „quill pin“) in die zu übertragende Lösung ein, und durch Adhäsion oder Kapillarkraft wird ein schlecht definiertes Volumen am Stift gehalten, was dann mit einem Nadeldruck auf die Oberfläche der Wahl übertragen wird (Eickhoff H, Konthur Z, Lueking A, Lehrach H, Walter G, Nordhoff E, Nyarsik L, Büssow K: Protein array technology: the tool to bridge genomics and proteomics. Adv Biochem Eng Biotechnol; 2002;77:103-12). Bei den hier beschriebenen und verwendeten, rekombinant hergestellten Proteinen wird in einem 4...8 M Harnstoffpuffer gearbeitet, der in der Routineproduktion von Arrays einige Schwierigkeiten bereiten kann. Da sehr schnell kristallisierend, können sich bei den verwendeten Nadeldruckverfahren während des Druckvorgangs Kristalle an den Nadelspitzen anlagern und so für ein unschönes Druckbild sorgen, was den Produktionsprozess und die Ausbeuten an Microarrays massiv beeinträchtigen kann.
Diese Kristallisationseffekte sind bei kontaktfreien Druckverfahren genauso präsent, können aber wesentlich besser kontrolliert werden. Dies ist durch zwei wesentliche Faktoren bedingt: So sind die radialen Öffnungen der Dispenserdüsen zwischen 50 und 100 µm klein, was bedeutet, dass die für eine Kristallisation notwendige Verdunstung nur in einem sehr marginalen Maße eintreten kann. Und zweitens: Kommt es trotzdem zu Ablagerungen, beispielsweise nach einer Probenaufnahme an der Außenseite der Dispenser, kann dies durch spezielle Beschichtungen an den Dispensern massiv eingeschränkt bis ausgeschlossen werden. Speziell zu diesem Zweck hat Scienion spezifische Beschichtungen entwickelt, die eine Ablagerung der Kristalle an der Dispenseroberfläche aus Glas erschweren bzw. unmöglich machen und somit die Grundlage für eine Produktion von diagnostischen Arrays auch in Fließbandverfahren schaffen.

Für die hier beschriebene Anwendung wurde ein Dispensiersystem der sci- FLEXARRAYER-Produktfamilie verwendet, die mittlerweile weltweit führend bei der Produktion von planaren Multiparameter-Tests ist. Je nach Anwendung und Durchsatz stehen sechs Größenversionen mit diversen Optionen zur Auswahl. Allen Geräten liegt dieselbe Technologie – das kontaktfreie und hochpräzise Dispensieren von Volumina im Piko- bis Nanoliter-Bereich – zu Grunde, wodurch ein schneller und einfacher Transfer von der Entwicklung in die Produktion garantiert ist. Mit den Systemen können biologische Substanzen, z.B. DNA, Oligonukleotide, Peptide, Proteine, Antikörper oder Glykane auf alle Formate von Glasträgern, Filterpads, Biosensoren, Siliziumwafern, Polymeren, MALDI-Targets bis zu Mikrotiterplatten gespottet werden. Die Abgabe der zu dispensierenden Substanzen erfolgt als einzelner Tropfen oder als Summe von Tropfen in Millisekunden von höchster Präzision und weist einen online gemessenen Dispensierfehler von weniger als 2,5 % auf. Die hochentwickelten optischen Systeme für die Tropfen- und Target-Erkennung ermöglichen eine Kontrolle der produzierten Arrays und garantieren damit eine gleichbleibend hohe reproduzierbare Qualität, die sich unter anderem durch hohe Sensitivität und exzellente Morphologie der Spots messen lässt.

Für die Durchführung der oben erwähnten multizentrischen Validierungsstudien von Protagen stellt Scienion Protein Microarray Batches mit jeweils über 3500 Einzelproteinen ISO-9001-2008-konform her. Höchste Qualität und Reproduzierbarkeit zeichnen die Microarray-Chargen in Stückzahlen von jeweils mehr als 1000 Arrays aus. Durch Nutzung der sciFLEXARRAYER-Technologie lässt sich die notwendige Konstanz in Qualität und Eigenschaften in drei Stufen realisieren: von Spot zu Spot, von Array zu Array und von Batch zu Batch.

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