Liquid-Dispensier-Automationsplattform Versette

Liquid-Dispensing

Präzise, reproduzierbar, automatisiert
Bild 1: Liquid-Dispensier-Automationsplattform Versette.

Tal Murthy, Ph.D.,*) und Kiara Biagioni**)

  1. Leiter Wissenschaftliche Applikationen im Bereich Automatisiertes Liquid Handling, Thermo Fisher Scientific.

  1. Produktmanagerin im Bereich Automatisiertes Liquid Handling, Thermo Fisher Scientific.
Wegen der beim High Throughput Screening transferierten minimalen Flüssigkeitsmengen – in der Regel im Mikroliterbereich – können bereits Ungenauigkeiten von nur 1 µl Experimente durch falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse in Frage stellen. Nachfolgend soll daher die Genauigkeit der Thermo Scientific Versette Liquid-Dispensier-Automationsplattform näher untersucht werden.

Im Zusammenhang mit der Automatisierung zentraler Prozesse in der Wirkstoffforschung ermöglicht HTS (High Throughput Screening = Hochdurchsatz-Screening) die Durchführung umfangreicher biochemischer Assays zur schnellen Identifikation aktiver Substanzen, Antikörper oder Gene von Interesse. Bei solchen Assays gilt es sicherzustellen, dass potenzielle Kandidaten für neue Wirkstoffe präzise und mit möglichst geringen Off-Target-Effekten (Nebeneffekten) identifiziert werden können. Zu diesem Zweck werden Hochdurchsatz-Assays genutzt, insbesondere als Ausgangspunkt beim Wirkstoff-Design sowie für die Untersuchung diverser intra- und interzellulärer Interaktionen.

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HTS ermöglicht das Screening einer Vielzahl statischer Assays auf der Grundlage einer umfassenden Bibliothek von Kandidatensubstanzen und damit die Identifikation und Analyse zellulärer Ereignisse, wie zum Beispiel der Kinaseaktivierung und -inhibition, der Hoch- und Herunterregulation von Signaltransduktionswegen und der Apoptose. Welche Assays im Rahmen einer Screening-Kampagne durchgeführt werden, hängt von den therapeutischen Zielen ab, also beispielsweise Krebserkrankungen, Herz-Kreis- lauf-Erkrankungen oder Entzündungsprozessen. Unabhängig von der Art des Assays ist in jedem Fall eine absolut präzise Methode für das Liquid-Dispensing notwendig, um ungenaue Ergebnisse und Fehler auszuschließen.

Der Notwendigkeit präziser Liquid-Dispensing-Methoden verdanken mehrkanalige Pipettiersysteme ihren Siegeszug. Heutzutage sind sie in den meisten Wirkstoffforschungslaboren anzutreffen. In vielen Fällen dient der Transfer von Flüssigkeiten zur Verdünnung konzentrierter Stammlösungen, die anschließend zu Analysezwecken in Assay-Platten dispensiert werden. Allerdings besteht bei der Herstellung von Verdünnungen ebenso wie beim Dispensieren von Lösungen immer ein Fehlerrisiko, das sich beim Erstscreening in Form falsch-positiver oder falsch-negativer Ergebnisse niederschlagen kann. Mit speziellen Geräten für das Liquid-Handling, die unter anderem auch beim pharmakologischen Nachweis von Substanzen zum Einsatz kommen, lassen sich wiederholte Dispensier-, Misch- und Aspirationzyklen in aufeinander folgenden Wells mit hoher Präzision durchführen. Anhand der daraus resultierenden Wirkstofftitrations- oder Dosis-Wirkungs-Kurven kann die Potenz von Wirkstoffkandidaten im Rahmen von Primärscreenings ermittelt werden. Präzision ist bei der Erzeugung von Verdünnungsreihen also entscheidend und bildet die Voraussetzung für die Auswahl der potentesten Substanzen, die sodann weiteren Analysen unterzogen werden können. Auf diese Weise lässt sich der Zeitaufwand für Hit-to-Lead- sowie Lead-to-Market-Prozesse minimieren.

Minimieren des Fehlerpotenzials

Aufgrund der üblicherweise äußerst geringen Volumina beim HTS – in der Regel im Mikroliterbereich – können bereits Ungenauigkeiten von nur 1 µl Experimente in Frage stellen. Durch falsch-positive Ergebnisse schlägt zwar nicht gleich das gesamte Experiment fehl, doch sie beeinträchtigen die Effizienz der Laborarbeit ganz erheblich. Wenn es einem Labor also gelingt, falsch-positive Ergebnisse weitgehend auszuschließen, erspart es sich unnötige Testwiederholungen und kann auch seine Reagenzienverluste minimieren. Durch falsch-negative Ergebnisse wiederum können unter Umständen vielversprechende Chancen übersehen werden und potenzielle Leitsubstanzen, die nicht bemerkt wurden, können erst durch eine größere Zahl regelmäßiger, umfassender Testwiederholungen ermittelt werden.

Die Thermo Scientific Versette Liquid-Dispensier-Automationsplattform wurde zum hochpräzisen Dispensieren von Flüssigkeitsmengen im Mikroliterbereich entwickelt. Die Leistungsfähigkeit des Systems wurde für ein breites Spektrum unterschiedlicher Flüssigkeitsmengen getestet, und zwar mit 1-, 8-, 12- und 96-kanaligen Pipettierköpfen. Auf diese Weise konnte die Genauigkeit des Systems über dessen gesamte Volumenbandbreite hinweg geprüft werden.

Mehrkanalverifizierung

Der Flüssigkeitstransfer wurde hausintern unter Verwendung von zehn vordefinierten Optimierungsparametern evaluiert, darunter Air Gap, Blow-Out, Aspiration- und Dispensiergeschwindigkeit, Overstroke und Höhe der Pipettenspitzen. Alle diese Parameter wurden nacheinander mithilfe einer Mehrkanalverifizierungstechnik untersucht, die eine doppelte Verifizierung mithilfe von Farbstoffen beinhaltet und zum Kalibrieren von Flüssigkeitsmengen auf einer Vielzahl von Automationsplattformen üblich ist. Diese Technik ermöglicht eine systematische Validierung von Geräten für das Liquid Handling. Das verwendete System besteht aus Färbelösungen (Probe und Verdünnungsmittel), einer Kalibrierplatte, einem Orbitalplattenmischer sowie einer Software zum Auslesen und Analysieren der Spektralphotometriedaten.

Mithilfe der 1-, 8- und 12-kanaligen Pipettierköpfe wurden drei unterschiedliche Flüssigkeitsmengen dispensiert, nämlich 2, 3 und 30 µl. So konnte die Präzision in einem breit gefächerten Mengenbereich evaluiert werden. Darüber hinaus wurden mithilfe des 96-kanaligen Pipettierkopfs fünf Flüssigkeitsmengen zwischen 0,5 und 30 µl dispensiert, um die Präzision des neuen Liquid-Handling-Systems beim Dispensieren zu prüfen. Denn nur anhand der Bewertung all dieser Parameter lassen sich zuverlässige Daten für den Einsatz des Versette-Systems in automatisierten Anwendungen ermitteln.

Die Präzision des Versette-Systems wurde anhand der folgenden Prozesse getestet:

  • Eine ausgewählte Menge an Farbstoff wurde in eine 96-Well-Platte dispensiert.
  • Die Platte wurde drei Minuten lang mit 1000 min–1 geschüttelt und eine Minute lang mit 1700 min–1 zentrifugiert.
  • Die spektralphotometrische Absorption wurde bei 412 nm gemessen.

Die ermittelten Ergebnisse wurden danach durch folgende Mehrkanalverifizierungstechniken überprüft:

  • Der entsprechende Farbstoff wurde mit dem Versette-System in eine 96-Well-Platte dispensiert.
  • Die Platte wurde eine Minute lang mit 1200 min–1 geschüttelt und eine Minute lang mit 1700 min–1 zentrifugiert.
  • Die spektralphotometrische Absorption wurde bei 412 nm gemessen.

Alle Daten wurden zur weiteren statistischen Analyse in eine Microsoft Excel-Kalkulationstabelle exportiert. Der Variationskoeffizient (VK in %) und die Fehlerspanne (Fehler in %) wurden anschließend mithilfe der Verifizierungssoftware für Mehrkanalsysteme berechnet.

Ergebnisse

Die unter Verwendung von 1-, 8-, 12- und 96-kanaligen Pipettierköpfen ermittelten Daten einschließlich Variationskoeffizient und Fehlerspanne (VK und Fehler, jeweils in %) wurden für ein breites Spektrum an Flüssigkeitsmengen direkt verglichen (siehe Tabelle 1).

Die Versette und das Mehrkanalverifizierungssystem erbrachten vergleichbare Ergebnisse, die zeigen, dass sich Flüssigkeiten mit der vielseitigen Versette Liquid-Handling-Plattform sehr präzise dispensieren lassen. Dies liegt unter anderem an der hochentwickelten, problemlos verstellbaren Pipettiermechanik, die für exzellente Genauigkeit sorgt. Fünf vorkalibrierte Flüssigkeitsklassen ermöglichen einen schnellen Wechsel zwischen verschiedenen Standardexperimentierlösungen und damit eine problemlose Leistungsoptimierung. Fehler bei den Experimenten aufgrund von Ungenauigkeiten beim Dispensieren lassen sich mit diesem System signifikant reduzieren.

Fazit

Automatisches Liquid-Handling ist Bestandteil jedes HTS-Protokolls. Zur Wahrung der Integrität von Experimenten und zur Sicherstellung präziser Ergebnisdaten müssen alle potenziellen Fehlerquellen weitestgehend ausgeschlossen werden. In diesem Zusammenhang ist die präzise Dosierung der Flüssigkeitsmengen beim Dispensieren von größter Wichtigkeit.

Die modulare Thermo Scientific Versette Liquid-Dispensier-Automationsplattform für das Liquid-Handling ist auf das Dispensieren genau dosierter Flüssigkeitsmengen zwischen 0,1 und 1250 µl ausgelegt. Das System ist mit 19 austauschbaren Pipettierköpfen (1 bis 384 Kanäle) kompatibel und wird auf diese Weise unterschiedlichsten Durchsatzanforderungen gerecht. Werden mit diesem System Verdünnungsreihen erzeugt, können die Anwender darauf vertrauen, dass falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse minimal bleiben, während sich der Durchsatz ohne Einbußen bei der Genauigkeit optimieren lässt.


Anmerkung
Die englische Originalversion dieses Artikels wurde in der Zeitschrift Genetic Engineering News im August 2010 veröffentlicht.

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