Micro-Array-Handling

Bestimmung allosterischer Kinase-Inhibitoren

Dr. Cristoph. M. Schultes*), Holger Schulz**), J. D. Lewis*)

  1. ELARA Pharmaceuticals GmbH, c/o EMBL, Meyerhofstraße 1, 69117 Heidelberg. E-Mail: c.schultes@elarapharma.com.
  1. Life Sciences, Rüsselsheim.
Um die Art der Wirkungsweise von Kinase-Inhibitoren zu bestimmen, wurden Experimente mit dem Caliper EZReader II durchgeführt. Diese Experimente nutzen die Möglichkeit des EZReaders, die Aktivität des Enzyms in Echtzeit zu messen und die Reaktionskinetik zu bestimmen. Es wurden der Einfluss einiger dieser Inhibitoren und Referenzsubstanzen auf die Reaktionskinetik bestimmt.

Die Inhibition von Zellzyklus-Kinasen ist in den letzten Jahren ein etabliertes Ziel für neuartige Krebschemotherapeutika geworden. Viele dieser Medikamente wirken durch direkte Bindung an die ATP-Bindungstelle und kompetitieren mit diesem Substrat um diese. Eine große Herausforderung besteht darin, dass viele Krebszellen eine Resistenz gegen diese Kinase-Hemmer entwickeln. Ein möglicher Weg, diese Resistenzen zu umgehen, wäre die Entwicklung sogenannter allosterischer Inhibitoren, die nicht an der ATP-Bindungstelle andocken und von daher eher indirekt wirken. Daher ist die Entwicklung von Resistenzen weniger wahrscheinlich.

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Die Kinase Aurora A ist ein Onkogen, das an dem Zusammenbau der mitotischen Spindel beteiligt ist. Eine Reihe von Inhibitoren dieser Kinase sind beschrieben worden und einige befinden sich bereits in klinischen Studien. Allerdings handelt es sich bei allen diesen Substanzen um ATP-kompetitive Inhibitoren. Mit Hilfe von In-silico-Modellen konnten einige Substanzen entwickelt werden, die an die Bindungstelle zwischen Aurora A und dem Mikrotubuli-assozierten Protein TPX2 binden. Die erwähnten Substanzen stören die Interaktion der Kinase mit diesem Protein und verhindern damit die Aktivierung der Kinase.

Material und Methoden

Die Proteine für die Versuche wurden in der Protein Production Core Facility am EMBL hergestellt. Diese bestehen aus einem his6-getaggten Aurora-A-Konstrukt und einem mit GST-fusioniertem Peptid, bestehend aus den ersten 43 Aminosäuren von TPX2 (entsprechend der Bindungsdomäne mit Aurora A), wie in der veröffentlichten Kristallstruktur (PDB code 1OL5) dargestellt (Bild 1).

Die Messung auf dem Caliper EZreader wurde in Caliper Separationbuffer (100 mM HEPES pH 7,5; 5 mM EDTA; 5 % DMSO; 0,0015 % Brij35; 0,002 % TWEEN 20; 0,1 % CR3; 0,1 % CR8) durchgeführt. Hierbei werden zur Trennung von Substrat und Reaktionsprodukt eine Spannung von 1750 V und ein Unterdruck von -1,8 psi angelegt. Als Substrat diente das Caliper Peptid 21 (5-FAM-LRRASLG-CONH2.

Für die in der Regel durchgeführten kinetischen Experimente wurde aus einem Well in der 384 well low volume plate alle 5 min mittels des Sippers ein Aliquot entnommen und vermessen. Die Auftragung von % Umsatz gegen die Zeit dokumentiert das Resultat (Bild 2).

Ergebnisse und Diskussion

Der erste Schritt war die Bestimmung der Enzymkonzentration (sowohl mit und ohne einer äquimolaren Konzentration des Cofaktors TPX2), die innerhalb von 2 h 50 % Umsatz ergab. Hierzu wurde eine serielle Verdünnung der Kinase bei 1 µM Peptid und 1 mM ATP durchgeführt. Der angestrebte Umsatz wurde bei einer Aurora-A-Konzentration von 1 nM, bzw. [Aurora A/TPX2] von 1 nM erreicht. Wichtig ist, dass die Umsatzgeschwindigkeit konstant war.

In einem zweiten Schritt wurde der ATP kM der Kinase in Gegenwart und Abwesenheit von TPX2 gemessen. Hierzu wird eine zweifache serielle Verdünnung von ATP, die mit 250 µM beginnt, vermessen (1 µM Peptide, 1 nM Enzyme). Daraus kann man die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (VMax) und kM bestimmen (Bild 3).


kM (-TPX2) 7,99 µM

kM (+TPX2) 5,74 µM

Für die Bestimmung der Ki-Werte von Referenz- und Testverbindungen wurden Experimente durchgeführt, die die Bestimmung einer allosterischen Inhibition erlauben und gleichzeitig den Effekt des Aurora-A-Bindungspartners TPX2 (der an die entsprechende Bindungstelle bindet) zu bestimmen. Daher wurde eine hohe ATP-Konzentration gewählt (100 µM), während die Protein- (1 nM) und Peptid- Konzentration (1 µM) konstant gehalten wurden. Unter den gewählten Bedingungen wird für Referenzsubstanzen erwartet, dass der ki bei höherer ATP-Konzentration zunimmt, wobei die Zugabe von TPX2, das nicht an die ATP-Bindungstelle bindet, keinen Effekt auf die Aktivität des Inhibitors zeigt. Für die Test-Substanzen hingegen sollte die Erhöhung der ATP-Konzentration keinen Effekt auf ki haben, während die Zugabe von TPX2 mit dem Liganden kompetitieren und von daher die Aktivität des Inhibitors verringern sollte.

Die Referenzverbindungen ELR-156441 (VX-680) und ELR-510409 (JNJ-7706621) zeigen das für ATP kompetitive Aurora-A-Kinase-Inhibitoren erwartete Ergebnis. Bei der hohen ATP-Konzentration, die für das Experiment gewählt wurde, ergab die Anwendung der Morrisongleichung in einem Vi/Vmax-Plot einen Ki von 14,3 nM bzw. 18,6 nM für ELR 156441 (+ bzw.- TPX2) und 112,1 nM und 113,5 nM für ELR 510409 (+ bzw.- TPX2). Diese sind deutlich höher als die beschriebenen kM für ATP (VX-680: Ki(app) 0,6 nM [2]; JNJ-7706621: IC50 11 nM [1]. Darüber hinaus zeigt die Zugabe von TPX2 keinen signifikanten Effekt auf die inhibitorische Potenz der beiden Substanzen. Das legt nahe, dass die Bindung an TPX2 nicht mit der Bindung dieser beiden Substanzen an die active site konkurriert.

Für die erste Substanz (ELR-580523), die aus einem In-silico-screen von EMBL/ELARA für allosterische Aurora-A-Inhibitoren stammt, konnte eine Inhibition von Aurora A beobachtet werden (Bild 4). Allerdings ließ sich Ki nicht bestimmen, da die Hemmung selbst bei hoher Inhibitor-Konzentration nicht komplett war. Die Zugabe von TPX2 zur Reaktion eliminierte fast vollständig den inhibitorischen Effekt, was in Übereinstimmung mit einem allosterischen Inhibitionsmechanismus ist. Daher wurde ELR-580523 für die Weiterentwicklung gewählt und eine Reihe von Strukturanalogen synthetisiert, um eine Struktur/Aktivitäts-Beziehung zu etablieren (SAR).

Mit dem Caliper LabCHip EZReader II wurden eine Reihe dieser Substanzen auf ihre Fähigkeit, Aurora-A-Aktivität zu hemmen, in An- bzw. Abwesenheit von TPX2 getestet. Allerdings zeigte die erste Serie dieser Substanzen (gezeigt am Beispiel ELR-510770) nicht den bei ELR-580523 beobachteten Effekt. Diese Substanzen werden in einer aktuellen Testreihe auf ihr Potential als allosterische Aurora-A-Inhibitoren getestet.

Literatur

  1. Emanuel, S.; Rugg, C. A.; Gruninger, R. H.; Lin, R.; Fuentes-Pesquera, A.; Connolly, P. J.; Wetter, S. K.; Hollister, B.; Kruger, W. W.; Napier, C.; Jolliffe, L.; Middleton, S. A., The in vitro and in vivo effects of JNJ-7706621: a dual inhibitor of cyclin-dependent kinases and aurora kinases. Cancer Res 2005, 65, (19), 9038-46.
  2. Harrington, E. A.; Bebbington, D.; Moore, J.; Rasmussen, R. K.; Ajose-Adeogun, A. O.; Nakayama, T.; Graham, J. A.; Demur, C.; Hercend, T.; Diu-Hercend, A.; Su, M.; Golec, J. M.; Miller, K. M., VX-680, a potent and selective small-molecule inhibitor of the Aurora kinases, suppresses tumor growth in vivo. Nat Med 2004, 10, (3), 262-7.
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