Fachbeitrag

Liquid Handling für miniaturisierte Testsysteme

Miniaturisierung ist einer der zentralen Zukunftstrends in der Bioanalytik
Bild 4: Online-Volumenbestimmung von dispensierten Tropfen. Mit einem Stroboskopblitzlicht werden dispensierte Tropfen angeleuchtet und mit einer CCD-Kamera live aufgenommen. Die gezeigte Bildschirmaufnahme ist ein Ausschnitt aus der sciFLEXARRAYER Software, auf dem die Düseneinstellungen links oben (blau hinterlegt: Pulshöhe 88 V, Pulslänge 48 µs, Tropfenfrequenz 500 Hz), das Livebild der CCD-Kamera mit dem automatisch identifizierten Tropfen rechts (Tropfenschwerpunkt im Fadenkreuz) und das dispensierte Volumen von 285 pl unten links angezeigt werden.

Dr. Holger Eickhoff*)

  1. CEO Scienion AG, Dortmund, eickhoff@scienion.de, http://www.scienion.de


Der Nutzen miniaturisierter Testsysteme liegt auf der Hand: Durch Miniaturisierung lassen sich wertvolle Substanzen einsparen und entsprechend werden Kosten reduziert. Verminderter Verbrauchsmittelaufwand und geringer Platzbedarf führen zu weiteren Kosteneinsparungen. Die Anwendungsgebiete sind breit gefächert: Von der Grundlagenforschung in Hochschulen und Forschungseinrichtungen über Screening-Verfahren in der Medikamentenentwicklung und Agro-Branche, Bioanalytik in der Lebensmittelindustrie bis hin zur Produktion von diagnostischen in vitro Tests. In nahezu allen Branchen der Lebenswissenschaften sind miniaturisierte Testsysteme gefragt.

Miniaturisierung in diesem Bereich ist heute untrennbar verknüpft mit Laborautomatisierung. Die zentralen Herausforderungen für die Etablierung miniaturisierter Testverfahren sind Präzision und Reproduzierbarkeit von Ergebnissen bei zugleich höchstmöglicher Automatisierung. Dies stellt hohe Anforderungen an den Dreh- und Angelpunkt für Laborautomatisierung: die Liquid Handling Workstations. Weitere Kriterien sind die Möglichkeiten zur Qualitätskontrolle, die Vermeidung von Kontaminationen, eine nutzerfreundliche Bedienung der Software und Flexibilität in der Anpassung für verschiedene Applikationen. Entsprechend ist in der Entwicklung und Verbesserung solcher Pipettierroboter eine enorme Dynamik zu verzeichnen.

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Zur Erinnerung: Es ist nur wenige Jahrzehnte her, dass noch in Volumendimensionen von Millilitern gearbeitet wurde. Heute ist die Geräteentwicklung so weit fortgeschritten, dass im ultra low volume liquid handling Volumina im Pikoliterbereich pipettiert werden können.

Ein Meilenstein in der Entwicklung miniaturisierter Testsysteme war die Entwicklung von Microarrays – eine Sammelbezeichnung für moderne molekularbiologische Untersuchungssysteme, die eine simultane Analyse von mehreren tausend Einzelnachweisen mit einer geringen Menge biologischen Probenmaterials erlauben.

Die Technologie der Microarrays ist erst in den 80er und 90er Jahren entstanden. Wegen der hohen Anzahl an Tests pro Zeiteinheit und der guten Automatisierbarkeit hat sich die Technik sehr schnell als wichtiger Forschungsbestandteil in der Genom- und Proteomforschung, Medizin, Biochemie, Genetik und Molekularbiologie durchgesetzt, findet aber nur sehr schleppend Eingang in die molekulare Diagnostik.

Derzeit sind Microarrays im Forschungsumfeld immer noch relativ teure Werkzeuge, wobei leicht Preise von mehreren hundert Euro pro Microarray im Markt verlangt und bezahlt werden. Da diese Preise für einen breiten Einsatz in der Diagnostik prohibitiv hoch sind, hat Scienion sehr früh ISO 9001-2008 konforme Produktionstechniken etabliert, die eine kostengünstige Produktion von Microarrays erlauben und somit einen Grundstein für den Einzug der Microarraytechnik in der Diagnostik darstellen. Schon heute ist Scienion in der Lage, Microarrays auf Fließbändern zu produzieren. Mit dieser Technik gelingt es, Arrays im Markt für unter 10 Euro/Array anzubieten, wenn diese in Mikrotiterplatten gedruckt werden können. Bei etwa 100 Fängermolekülen pro Array liegen die Produktionskosten für einen Analyseparameter (Auswertung eines Punktes bzw. Parameters) auf dem Array bei unter 10 Cent. Dies ist ein Wert, der in einigen Anwendungen, z.B. in der viralen Diagnostik, durchaus als wettbewerbsfähig gegenüber etablierten Verfahren angesehen werden darf.

Zwei Anwenderbeispiele von miniaturisierten Testverfahren sollen hier ausführlicher erläutert werden: Die Durchführung von nanoPCR1) und ein zellbasierter Toxizitätstest in Nano-Tröpfchen2).

Nanoliter-PCR spart Kosten und Zeit

Die Kombination hochpräziser Dispenser im Piko- und Nanolitervolumenbereich und stark miniaturisierter Mikrotiterplattenformate ermöglicht die Durchführung von PCR-Reaktionen in Nanolitervolumina. Die kleinen Volumina erlauben schnelle Heiz- und Kühlschritte und die Durchführung einer kompletten PCR in weniger als 10 Minuten. Dabei werden im Vergleich zu Standardsystemen typischerweise maximal 10 % der Reagenzien eingesetzt, was insbesondere im Hochdurchsatzbetrieb zu massiven Kosteneinsparungen führt. Kombiniert mit Fluoreszenzdetektion in Echtzeit oder als Endpunktbestimmung ermöglicht die hier vorgestellte Kombination einen sensitiven, kosteneffektiven und schnellen Nachweis von Nukleinsäuren.

Miniaturisierte Mikroplattensysteme sind offene Plattformen, die mit geeigneten Dispensern leicht und wenn nötig mehrfach befüllt werden können und so für eine Vielzahl von Assays nutzbar sind. Die Verwendung von offenen Kavitäten in PCR kompatiblem Polypropylenmaterial erlaubt dabei eine freie Auswahl von einzelnen Reaktionsplätzen und die Adaptierbarbeit an verschiedene Assays und Detektionssysteme (Bild 3). Diese im Vergleich zu geschlossenen Systemen größere Flexibilität in der Applikationsentwicklung gab den Ausschlag für die Verwendung von miniaturisierten Testplatten für die hier dargestellten Ergebnisse.

Für die Befüllung der Reaktionskavitäten werden flexible, kontakt- und kontaminationsfrei arbeitende Dispensiersysteme (sciFLEXARRAYER) verwendet. Die dabei dispensierten Volumina liegen zwischen 100 pl und 200 nl (Bild 4). Die Abgabe dieses Volumens erfolgt als einzelner Tropfen oder als eine Summe von Tropfen in weniger als einer Sekunde und weist dabei einen online gemessenen Dispensierfehler von weniger als 2,5 % auf. Neben dieser hohen Präzision sorgt die Geschwindigkeit der abgegebenen Tropfen, typischerweise etwa 2–3 ms, dafür, dass eine effiziente Mischung der Reaktionspartner erfolgt, bevor der erste Schritt im PCR-Protokoll gefahren wird.

Die einzelnen experimentellen Schritte erfolgen dabei ähnlich wie in manuellen oder konventionellen Laborautomatisierungssystemen: Reaktionsmixe, Primer und Templates werden mit dem Dispenser in den miniaturisierten Testplatten gemischt und diese Testplatten mit transparenten Folien verschlossen. Nach Überführung in eine integrierte Temperatur- und Detektionseinheit kann die Intensität der Fluorophore in „Real-Time“ nach jedem Zyklus mit einer CCD-Kamera aufgenommen oder nur eine Detektion als Endpunktbestimmung durchgeführt werden. Die dabei erfassten Intensitätsdaten werden für die einzelnen Kavitäten integriert, mit Standards abgeglichen und in den hier gezeigten Experimenten mit Standard-Tabellenkalkulationsprogrammen ausgewertet.

Die Zykluszeiten der Nano-PCR sind, verglichen mit den benötigten Zeiten von Standardsystemen, sehr viel kürzer. Dies ist im Wesentlichen auf einen effizienteren Wärmetransfer, der durch die relativ zum Volumen großen Oberflächen möglich wird, zurückzuführen. Gleichzeitig wird durch die Miniaturisierung auch der Energieverbrauch pro Reaktion stark verringert.

Bei der hier vorgestellten leistungsfähigen Plattform sind Kapazität und Durchsatz etwa 10x höher ist als bei konventionellen Systemen. Dabei werden die Kosten durch die Miniaturisierung massiv gesenkt und betragen, abhängig vom Durchsatz, in der Regel nur noch etwa 10 % der Kosten einer Standard-PCR-Reaktion.

Zentrale Anwendungen der hier gezeigten Technologieplattform sind Real-Time PCR basierte Genexpressionsanalysen und SNP Genotypisierungen. Dabei können im miniaturisierten Format die Assaykomponenten für konventionelle PCR, qPCR oder sondenbasierte homogenere Assays eingesetzt werden, so dass nach erfolgter Protokollanpassung mit vergleichbaren Ergebnissen gerechnet werden kann.

Multiplexe Toxizitätstests in Nano-Tröpfchen

Grundsätzlich nimmt die Verbreitung von zellbasierten in-vitro-Toxizitätstests gegenwärtig stark zu, um die Anzahl von Tierversuchen zu begrenzen. Auch in diesem Forschungsfeld geht es darum, Testverfahren zu miniaturisieren, um den Verbrauch an kostbaren Substanzen wie Entwicklungskandidaten für Medikamente zu reduzieren, aber auch, wenn bestimmte Zellarten nur in begrenzter Menge verfügbar sind, beispielsweise bei schwierig zu kultivierenden Zellen oder bei Material aus Patientenbiopsien.

Mit dem hier vorgestellten Cell-on-Chip-Test wurde im Laboratoire Biopuces, CEA, ein Multiparameter-Bioassay entwickelt, mit dem zytotoxische Effekte von Substanzen auf Zellen getestet werden können. Dafür wurde ein stressinduzierbares Zellmodell (HepG2) entwickelt, das auf Cadmium, Arsen und Paraquat mit der Aktivierung eines Stresspromotors und dadurch Expression eines fluoreszenzmarkierten Proteins reagiert.

Es werden mehrere Hundert einzelne Nanolitertröpfchen mit dem sciFLEXARRAYER auf ein Glassubstrat aufgebracht. Diese Tröpfchen verhalten sich wie unabhängige Zellkulturen und stellen einen eigenen Reaktionsraum dar. Der Tropfen als Reaktionsraum bietet selbst kleinsten Microwells gegenüber mehrere Vorteile: Hohe Effizienz im Gasaustausch, kontinuierliche Flüssigkeitsbewegung, keine Anhaftung von Chemikalien an Plastikwände und eine uneingeschränkte Analyse des gesamten Assays, da es keine Schatten von Well-Rändern gibt. Nach sechsstündiger Inkubation mit den toxischen Substanzen in einer Verdünnungsreihe wird der Chip gewaschen und anschließend in ein Kulturmedium überführt, um die Expression des Proteins zu ermöglichen. Nach vier Tagen werden die Träger fixiert, gefärbt und analysiert. Die Auswertung erfolgte mit einem IMSTAR-System, das eine automatische Bilderfassung und -analyse ermöglicht. Dadurch werden nicht nur das Überleben von Zellen und Fluoreszenzintensitäten analysiert, sondern auch die Zellmorphologie, die wertvolle Informationen über das Verhalten von Zellen unter Einfluss der Substanzen geben kann.

Mit diesem Assay konnten zytotoxische Wirkungen von Cadmium, Arsen und Paraquat nachgewiesen werden. Besonders ermittelte IC50-Werte stimmen mit publizierten Daten überein. Bei subletalem Stress konnte die Bedeutung und höhere Sensitivität beider Parameter, der Stresspromotoraktivierung und der Zellmorphologie, bei der Erfassung der Zellantwort auf die toxischen Substanzen herausgestellt werden.

Die Ergebnisse zeigen eine erste Generation von high throughput und high content assays, die geeignet sind, chemische Gefährdungen in vitro zu beurteilen.

Referenzen

1) Siehe auch sciFLEXARRAYER Application Note 08004 auf der Scienion Website; Originalpublikation: Dahl, A.; Sultan, M.; Jung, A.; Schwartz, R.; Lange, M.; Steinwand, M.; Livak, KJ.; Lehrach, H.; Nyarsik, L.: Quantitative PCR based expression analysis on a nanoliter scale using polymer nano-well chips, Biomed Microdevices. 2007.

2) Siehe auch sciFLEXARRAYER Application Note 08003 auf der Scienion Website; Originalpublikation: Lemaire, F. et al. (2007), Toxicity Assays in Nanodrops Combining Bioassays and Morphometric Endpoints, PloS One (1) e163.

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