In der Regel erfolgt die Alkoholgehaltsbestimmung von Wein über die Destillation. Doch kann auch die Spektralphotometrie in Verbindung mit einer enzymatischen Reaktion ein genaues Verfahren zur Alkoholgehaltsbestimmung darstellen. Im Folgenden wird das Verfahren erläutert und ein Messbeispiel gezeigt.

Wenn eine Substanz mit Licht der Intensität I₀ bestrahlt wird, wird ein Teil der Strahlung durch die Moleküle der Substanz absorbiert und eine verbleibende Intensität I wird reflektiert oder transmittiert. Dies erfolgt gemäß dem Lambert-Beer‘schen-Gesetz. Die Absorption ist proportional zu Weglänge L und Konzentration c einer Substanz. Sie wird bestimmt durch den molaren Absorptionskoeffizient (in Bild 1 mit α symbolisiert). Er ist – bei einer bestimmten Wellenlänge und Temperatur – spezifisch für jede Substanz und jede Messmethode. L ist die Weglänge in cm. Dies entspricht der „Dicke“ der Probe, was in der Praxis durch den Durchmesser der Messküvette bestimmt wird. c ist die Stoffkonzentration in mol/l. Das ist die Grundlage für alle quantitativen Gehaltsbestimmungen in der Photometrie: Durch den Vergleich der gemessenen Lichtabsorption mit der Absorption bei einer bekannten Konzentration der Substanz lässt sich die Konzentration der Substanz in der gemessenen Probe berechnen.

Photometrische Messungen müssen bei der für den jeweiligen Substanz-Chemikalien-Komplex charakteristischen Wellenlänge durchgeführt werden. Daher spielt das Spektrum, das von einem Photometer erzeugt werden kann, eine wichtige Rolle. Ein Spektralphotometer kann in der Regel einen größeren Wellenlängenbereich als den des sichtbaren Lichts abbilden. Das Spektralphotometer „iris“ von Hanna Instruments deckt den Bereich von 390 nm bis 900 nm ab (Bild 2). Die eingebaute Wolfram-Halogenlampe zeigt eine gleichmäßige Lichtqualität über das gesamte Spektrum. Eine Besonderheit dieses Spektralphotometers ist die Technologie des doppelten Strahlengangs oder „Split Beam“. Dabei wird ein Teil des Lichtstrahls durch die Probe, der andere Teil auf einen Referenzdetektor geleitet (Bild 3). Dadurch kann z. B. eine lange Aufheizzeit des Photometers vermieden werden, da die Lichtintensität, die bei der Messung auf den Lichtdetektor trifft, mit der vom Referenzdetektor ermittelten Lichtintensität in Bezug gesetzt und somit größtmögliche Genauigkeit erreicht wird. Mehrere Linsen innerhalb des Strahlengangs, die den Lichtstrahl fokussieren und Streulicht verhindern, bewirken eine hohe Präzision. Ein Filterwechselrad hilft bei der Auswahl der gewünschten Wellenlänge mit schmalen Bandbreiten, was eine Überlappung mit unerwünschten Wellenlängen verhindert. Über die voreingestellten Methoden hinaus können bis zu 100 benutzerdefinierte Methoden gespeichert werden. Dabei sind die Messergebnisse nicht auf die reine Ermittlung der Absorption beschränkt, sondern können vom Gerät in der gewünschten Konzentrationseinheit ausgegeben werden.

Alkoholbestimmung in Wein

Mit einem Spektralphotometer kann die Bestimmung der Alkoholkonzentration über eine einfache enzymatische Reaktion erfolgen. Generell eignen sich hierzu handelsübliche Enzym-Testkits für Ethanol. Die enzymatische Reaktion ist notwendig, weil Ethanol selbst im sichtbaren Wellenlängenbereich photometrisch nicht gemessen werden kann. Es gibt keine Reagenzien, die eine dem Ethanolgehalt entsprechende Färbung erzeugen würden. Man bestimmt den Alkoholgehalt daher indirekt über die enzymatische Umwandlung von NAD⁺ (NAD = Nicotinamidadenindinukleotid) zu dessen reduzierter Form NADH in Anwesenheit von Ethanol.

Das Absorptionsspektrum von NAD⁺ und NADH ist dabei unterschiedlich. Beide Substanzen haben zwar jeweils ein Absorptionsmaximum bei ca. 260 nm, NADH hat jedoch ein weiteres Absorptionsmaximum bei 340 nm, welches das NAD ⁺-Spektrum nicht aufweist.

In der Praxis besteht die Durchführung der Methode in der Zugabe von Ethanol zu NAD⁺. Es bildet sich NADH, das dann bei einer Wellenlänge von 340 nm photometrisch nachgewiesen werden kann. Es werden zwei Teile NAD⁺ benötigt, um einen Teil Ethanol in NADH umzuwandeln, d. h., die gebildete Menge an NADH entspricht der doppelten Menge an Ethanol. Die tatsächliche Menge an Ethanol wird daraus durch Division durch zwei berechnet.

Absorption nach dem Lambert-Beer‘schen Gesetz. © petrroudny/stock.adobe.com

Das enzymatische Ethanol-Kit von Megazyme (www.megazyme.com), was in dieser Beispielmessung verwendet wurde, enthält alle für die Messung notwendigen Reagenzien und Enzyme sowie eine genaue Anleitung zur Durchführung der verschiedenen Messmethoden und der Probenvorbereitung. Zur Probenvorbereitung sind je nach Probenart weitere Reagenzien notwendig. Weinproben müssen in der Regel nicht besonders vorbereitet werden. Doch je nach erwartetem Alkoholgehalt müssen die Proben der Anleitung entsprechend verdünnt werden. Beispielsweise ist für Weine mit 10 – 15 % Alkoholgehalt eine Verdünnung von 1 : 1 000 und ein Probenvolumen von 0,1 ml erforderlich.

Die erhaltene Absorbanz kann in das von Megazyme mitgelieferte Kalkulationsprogramm eingetragen und als Ethanol in g/ml oder % w/v ausgegeben werden. Der Eintrag der A1-Werte (Blankwerte für den Nullabgleich) ist mit dem Spektralphotometer „iris“ nicht notwendig, da das Gerät die Differenz aus Blank und Probe automatisch bildet. Es reicht daher aus, diese Differenz als A2-Wert einzutragen.