Die Spitze der MS-Evolution

Non Target ist das neue Target

Während die klassische Target-Analytik eine überschaubare Anzahl an Substanzen überwacht, geht der Non Target-Ansatz sowohl in der Zielsetzung, als auch beim technischen Aufwand viel weiter.

Die moderne hochauflösende Tandem-Massenspektrometrie strebt das Ziel an, nahezu jede ionisierbare Substanz mittels ihrer molekularen Zusammensetzung aufzuspüren. Bei der klassischen Target-Analytik wird eine taxative Liste von Substanzen analysiert, für die jeweils Kalibrierstandards vorhanden sind und auf die nicht nur qualitativ, sondern auch quantitativ referenziert werden kann. Diese Methoden umfassen meist eine geringe bis mittlere Anzahl von Zielanalyten (wenige zig) und sind auf sowohl hohe Selektivität, als auch niedrige Bestimmungsgrenzen getrimmt. Es sind aber auch Target-Methoden mit z. B. 200 Zielsubstanzen im Routineeinsatz, die noch mit niederauflösenden Triple Quads (QqQ bzw. QqLIT) bewältigt werden können.

Bei einer wesentlichen Erweiterung des Analytenspektrums kommt man bereits in den Bereich des sog. Suspected Target-Screenings, das oft auch nur kurz als Target-Screening bezeichnet wird. Obwohl es sich um ein Screening-Verfahren handelt, wird doch auf eine bestimmte definierte Anzahl von zu erwarteten oder zu überwachenden Substanzen mit meist sehr langer „Fahndungsliste“ untersucht. Der Unterschied zur Target-Analytik ist in erster Linie die wesentlich größere Schar an potenziellen Analyten und vor allem, dass beim Screening nicht jede Substanz auch als Referenzstandardlösung im Labor vorhanden sein muss, um identifiziert zu werden. Das wird vielmehr über den Vergleich mit Referenzdatenbanken bewerkstelligt. Deren Einträge wie Retentionszeit, Summenformel und MS/MS-Parameter (Vorläuferionen und Produktionen-Spektren) dienen als primäre Identifizierungskriterien.

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Suche nach dem Unbekannten

Der sog. Non Target-Screening-Ansatz geht hingegen davon aus, dass kein zielgerichteter Verdacht hinsichtlich der anzutreffenden Analyten besteht und daher erst einmal mit Hilfe der Massenspektrometrie eine möglichst umfassende Informationsmenge über die Probe aufgenommen werden muss. Anschließend oder jederzeit auch nachträglich (retrospektiv) kann die aufgezeichnete Datenflut dieses Unknown Screenings auf Merkmale von sog. „Known Unknowns“ durchsucht werden. Dabei werden die MS-Spektren der bekannten Unbekannten in den meisten Fällen nicht mit den Spektren von Referenzsubstanzen des Labors verglichen, sondern mit Spektren von MS-Datenbanken. Denn ähnlich wie bei der Suspected Target Screening-Liste stehen nur relativ wenige Substanzen auch tatsächlich als Reinsubstanzen im Untersuchungslabor zur Verfügung.

Darüber hinaus kann die umfangreiche Datenmatrix des Non Target-Screenings mit speziellen statistischen Methoden, wie der multivariaten Datenanalyse (z. B. Principal Component Analysis PCA), sogar auf Unterschiede zwischen ähnlichen Probentypen (zum Beispiel in der Gewässerkontrolle) überprüft werden, um auf eventuell neu auftauchende Kontaminanten schließen zu können (sog. „Unknown Unknowns“).

Für die Aufnahmetechnik in der Massenspektrometrie bedeutet der Non Target-Ansatz, dass im einfachsten Fall mit Full Scan-Aufzeichnungen grundsätzlich so viel wie möglich an Informationen gesammelt werden. Erst nachher wird entschieden, welcher Teil davon näher betrachtet werden soll und welche Informationen sich daraus gewinnen lassen. Für dieses Unknown Screening wurden MS-Kombinationen mit sehr schnell scannenden Massenanalysatoren (z. B. Time of Flight TOF) entwickelt, die nun tatsächlich in der Lage sind, auch unbekannte Schadstoffe empfindlich ausfindig zu machen, bzw. welche ein sog. retrospektives Data-Mining erlauben.

Das Ziel ist, möglichst alles zu erfassen, das sich chromatographieren und vor allem ionisieren lässt. Damit inkludiert man bei der Datenakquisition indirekt auch sog. „Emerging Contaminants“ sowie Metabolite und Transformationsprodukte von Schadstoffen, von denen man noch gar nichts ahnt, um sie später bei Bedarf aus der Informationsflut zu extrahieren und auszuwerten. Im Gegensatz zur Target-Analytik müssen dafür immer komplette Massenspektren über einen relativ großen Massenbereich aufgezeichnet werden. Und das mit sehr hoher Datenrate, um auch schmale Peaks in guter Qualität erfassen zu können. Obwohl es sehr schnell scannende Triple Quads gibt, ist der Scan-Prozess bei dieser Technik doch noch immer ein serieller, bei dem die m/z-Stufen schrittweise abgetastet werden müssen. Das kostet jene Zeit, die auf Kosten der Verweildauer pro Fragment geht, und daher bricht die Empfindlichkeit klassischer Triple Quads im Full Scan-Modus stark ein. Selbst die QqLIT-Version mit einer linearen Ionenfalle (Linear Ion Trap), welche eine gewisse Zeitperiode lang Ionen ansammeln und speichern kann und damit im Scan etwas weniger Sensitivität einbüßt, ist für uneingeschränktes Non Target-Screening nicht gut geeignet.

Alleine aus diesem Grund haben simultan erfassende Massenspektrometer wie das TOF den entscheidenden Vorsprung zugunsten schneller Full Scan-Techniken.

Summenformeln aus der akkuraten Masse

Bei der „gerichteten“ Suche nach „Known Unknowns“ ist die Bestimmung der molekularen Zusammensetzung in Form der Summenformel von zentraler Bedeutung. Die mit der Massenspektrometrie gewonnenen Informationen können in der Folge durch den Abgleich mit online-Datenbanken wie Chemspider (www.chemspider.com), Chemicalize (www.chemicalize.org) etc. und massenspektrometrischen Datenbanken wie DAIOS (www.daios-online.de), MassBank (www.massbank.eu) etc., selbst erstellten oder kommerziell erhältlichen Spektrensammlungen oder auch mit In-Silico-Vorhersagen (Computer-simulierten Spektren) zu immer eindeutigeren Erkenntnissen verdichtet werden [1].

Bild 1: Isotopenverhältnisse und deren Intensitätsstreuung (in %; grün) bzw. hochauflösende Massenbestimmung (Ungenauigkeit in ppm; blau). © Agilent Technologies

Die wichtigste Anforderung an ein System für Unknown Screening-Applikationen ist die massenspektrometrische Hochauflösung (High Resolution HR). Nur mit ihr gelingt die Bestimmung der akkuraten monoisotopischen Masse (Accurate Mass AM; Bild 1), aus der, unter Berücksichtigung der erzielbaren Massengenauigkeit, auf die Zusammenstellung möglicher Summenformeln geschlossen werden kann [2]. Im Gegensatz zu kleinen Molekülen, für die es nur wenige passende Möglichkeiten der elementaren Zusammensetzung gibt, wird die Liste theoretisch möglicher Summenformeln mit steigender Masse und/oder zunehmender Anzahl an Heteroatomen exponentiell länger. In Bild 2 (rot) wird die Anzahl von berechneten, chemisch möglichen Formeln in Abhängigkeit von der Masse dargestellt (die Ausreißer bei ca. 600 Dalton haben sich als halogenhaltige Verbindungen herausgestellt). Für die Berechnung wurden 1 200 zufällig ausgewählte Moleküle mit einer simulierten Massengenauigkeit von 3 ppm und einem Isotopenverhältnis-Messfehler von ± 5 % herangezogen [2].

Die natürlich vorkommenden Elemente sind oft Mischungen aus mehreren Isotopen des gleichen Elements, die das Massenspektrometer gut unterscheiden kann. Die gemessenen Isotopenmuster sind daher wichtige Indizien bei der Ermittlung der elementaren Zusammensetzung (Bild 1).

Das Isotopenmuster von Kohlenstoff (12C/13C = 98,90/1,10) ist zwar nicht sehr ausgeprägt, tritt aber praktisch bei allen organischen Substanzen auf und lässt auf die ungefähre Anzahl an C-Atomen schließen. Während die Präzision bei der Massenbestimmung mittels TOF oder Orbitrap extrem hoch ist (Unsicherheit im ppm-Bereich; Bild 1 blau; horizontal), ist die Streuung beim Response und damit bei den Intensitätsverhältnissen (Bild 1 grün; Prozent-Bereich vertikal) wesentlich höher. Dadurch kann z. B. die Anzahl der Kohlenstoffatome nicht sehr präzise abgeschätzt werden.

Sehr charakteristisch und wesentlich markanter sind hingegen die Verhältnisse bei Chlor (35Cl/37Cl = 75,43/24,57) und Brom (79Br/81Br = 50,44/49,56), die damit wertvolle Informationen preisgeben. Darüber hinaus sind auch MS/MS-Fragmentmuster hilfreich, die wiederum ausgehend von verschiedenen Precursor-Ionen auf bestimmte Strukturen schließen lassen.

Wenn auch noch verschiedene Stellungsisomere in Frage kommen, werden weitere Identifizierungsparameter wie insbesondere die Retentionszeit erforderlich, um die Kandidaten einzugrenzen.

Hochauflösung und Heuristik

Zur Unterstützung bei der Datenexploration werden auch heuristische Verfahren eingesetzt, die in der Lage sind, die theoretisch möglichen Summenformeln noch einmal wesentlich zu reduzieren. Bei Anwendung der Filterwirkung des sog. „Seven Golden Rules (Sieben Goldene Regeln)“-Verfahrens [2] wird systematisch auf jene Summenformeln eingeschränkt, welche als wahrscheinlich gelten. Diese sieben Regeln basieren sowohl auf der Einhaltung chemischer Grundprinzipien (z. B. Lewis Oktett-Theorie), als auch auf Erfahrungswerten. So werden z. B. Verbindungen, welche ein sehr unwahrscheinliches Verhältnis zwischen C und H aufweisen, eliminiert. Bild 2 verdeutlicht anschaulich, wie die Anwendung der „Seven Golden Rules“-Methode die mögliche Anzahl potenzieller Varianten reduzieren kann (grün).

Bild 2: Potenzial eines heuristischen Verfahrens zur Reduktion der Kandidaten bei der Vorhersage von theoretisch möglichen Summenformeln. Rot: Anzahl der berechneten Formeln mit einem üblichen Molekülgenerator; grün: Anzahl der Formeln unter Anwendung der „Seven Golden Rules“-Methode. © 2007 Kind and Fiehn; http://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-8-105

Die Hochauflösung ist die grundsätzliche Voraussetzung für eine gute Massengenauigkeit, die relativ gesehen in ppm (parts per million) angegeben wird. Eine Massengenauigkeit von technisch dzt. üblichen 4 ppm bedeutet für ein Ion mit 500 m/z, dass die exakte Masse 500,0000 ± 0,0020 m/z beträgt.

Bild 3: Vergleich der notwendigen Massengenauigkeit zur Einschränkung möglicher Summenformeln und der Leistungsfähigkeit von Quadrupolen vs hochauflösende Time of Flight-Geräte. © Agilent Technologies

Bild 3 zeigt den Zusammenhang zwischen der Unsicherheit bei der Massenbestimmung („mass uncertainty“) in ppm und der Anzahl möglicher Summenformeln für das relativ simple Molekül Oktafluornaphthalin C10F8. Während Quadrupole (rot) maximal auf 0,1 m/z auflösen können und daraus theoretisch über 4 000 mögliche Summenformeln resultieren würden, schränkt ein HRMS (z. B. TOF; grün) mit 4 ppm Massengenauigkeit die Anzahl auf 43 ein. Kann die Unsicherheit auf 1 ppm reduziert werden, bleiben nur noch elf Kandidaten übrig.

„Massenweise“ mehrdimensionale Informationen

Diagnostische Ionen im hochaufgelösten Full Scan-Spektrum, d. h. Fragmente, welche charakteristisch für bestimmte Substanzen oder zumindest Substanzklassen sind, spielen eine Schlüsselrolle bei der Identifizierung von Unbekannten, egal ob sie aus der hochaufgelösten Singlestage-MS (ST-HRMS) stammen oder Produktionen aus einem Tandem-System sind.

Bei der ungezielten Full Scan-Datenaufnahme müssen sie vorerst ohne Selektion eines Precursors meist in einem eigenen Event aufgenommen werden.

Bei Tandem-Konfigurationen können alle Ionen aus der Ionenquelle in der zwischen den zwei MS-Analysatoren liegenden Kollisionszelle bei einer einzigen oder mehreren verschiedenen Kollisionsenergien („Collision Energy Spread“ CES) bzw. mit dem sog. „Energy Ramping“ aufgespalten werden. Je nach Hersteller nennen sich diese Techniken „All Ion Fragmentation“ (AIF), „All Ions MS/MS“, „broadband CID“, „MSE“ (Elevated Energy) etc..

Neuere Verfahren gehen einen Mittelweg zwischen All Ion Fragmentation und klassischen MS/MS-Techniken, indem der Massenbereich für die Vorläuferionen in mehrere Scan-Events aufgespalten wird. Dabei werden die Massenbereiche ständig verkleinert (25 – 100 m/z), isoliert und abschließend fragmentiert (vDIA „Variable Data-Independent Acquisition“).

Bild 4: Konfiguration eines hochauflösenden Orbitrap-Hybrid-MS mit der sog. C-trap zur Zwischenspeicherung der Ionengruppen (oben) und Selektivitätsgewinne durch fortschrittliche Datenaufnahmetechniken bei einer Weizenprobe. „All Ion Fragmentation” (mitte) vs “variable Data-Independent Acquisition” (unten). © Thermo Scientific Technical Note 64394

Besonders bei komplexen Proben sind solche Verfahren der AIF überlegen (Bild 4 unten). Die Sensitivität wird z. B. beim vDIA-Verfahren mit der Quadrupol-Orbitrap Hybrid-MS (Bild 4 oben) durch die höhere Anzahl von Precursor-Ionen eines Analyten in der C-Trap verbessert, und gleichzeitig steigt die Selektivität, da die gebildeten Fragmente von einem kleineren Bereich an Vorläuferionen stammen.

Bild 5: Umfassende und fortschrittliche MS/MS-Aufnahmetechniken mit einem hochauflösenden Q-TOF generieren dreidimensionale Datenfelder, die mit intelligenter Erkennungs-Software durchsucht werden können. © AB Sciex (Photos are provided courtesy of AB Sciex Pte.Ltd.); modifiziert W. Brodacz

Ein ebenfalls umfassender MS/MS-Akquisitionsmodus („MS/MSALLwith SWATH®“), der gerne für Proteomics verwendet wird, basiert auf folgendem Workflow. Der Quadrupol Q1 des Q-TOF (Bild 5 unten links) fährt z. B. mit einer MS-Spannweite von 25 Da den interessierenden Massenbereich ab und schickt jedes Packet in die Kollisionszelle (CID). Die entstandenen Fragmente werden im schnell scannenden TOF hochauflösend analysiert und dem aktuellen Precursor-Bereich zugeordnet. In Abhängigkeit von der Spreizung der Vorläuferionen kann die Spannweite in Q1 optimal angepasst werden. Die permanente Wiederholung dieser Aufnahmesequenzen über den begutachteten Massenbereich (m/z) über die gesamte Chromatographiezeit (Time) ergibt in Kombination mit den HR-Vollspektren ein dreidimensionales Datenfeld (Bild 5 oben). Die Datenmatrix kann nach der umfassenden Akquisition mittels definierter Fragmentierungsmuster oder MS-Datenbanken ebenso umfassend abgesucht werden. Werden enge Erkennungsfenster über die Target-Massenfragmente gelegt, können nachträglich spezifische Ionenchromatogramme extrahiert und quantifiziert werden (Bild 5 unten).

Suche im Heuhaufen

Wird die Hardware-Kombination von Tandem-Massenspektrometrie mit Hochauflösung von einer intelligenten Datenaufnahmestrategie gesteuert, können umfassende, mehrdimensionale und akkurate MS-Daten aufgezeichnet werden. Moderne Auswerte-Software mit Heuristik- und Statistik-Unterstützung kann diese Datenflut dann retrospektiv nicht nur auf eine riesige Anzahl bekannter Substanzen durchsuchen, sondern z. B. auch neue, unbekannte Schadstoffe durch Abgleich mit mächtigen MS/MS-Datenbanken aufspüren. Nur durch das Zusammenspiel dieser fortschrittlichen Technologien kann man dem Traum der Analytiker einen wesentlichen Schritt näherkommen, nämlich neben der sprichwörtlichen Nadel auch alles andere „Spitzige“ im riesigen Heuhaufen zu entdecken.

Referenzen
[1] Letzel Th. “Molekülgenaue Detektivarbeit (Non Target Screening, Suspected-Target Screening und Target Screening – von Technologien und Philosophien, von Datenbanken und vom Handwerk)”; labor&more 4.13, S 30 – 35; 2013

[2] Kind, Tobias, and Oliver Fiehn. “Seven Golden Rules for Heuristic Filtering of Molecular Formulas Obtained by Accurate Mass Spectrometry.” BMC Bioinformatics 8 (2007): 105. PMC. Web. 21 July 2016.; http://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-8-105

AUTOR
Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit
Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik, Linz

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