Exzision viraler Vektoren aus iPS-Zellen unter Verwendung von zellmembrangängigem TAT-Cre-ProteinEffiziente Gewinnung transgenfreier iPS-Zellen
In diesem Artikel beschreiben wir die effiziente Erzeugung von transgenfreien murinen und humanen iPS-Zellen durch Verwendung eines Cre-exzidierbaren polycistronischen lentiviralen Vektors, der die "Stammzellkassette" (STEMCCA™ cassette) exprimiert, die alle vier Transkriptionsfaktoren enthält, gefolgt von der Exposition der voll reprogrammierten iPS-Zelle gegenüber dem rekombinanten zellmembrangängigen TAT-Cre-Protein.
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Bild 1. Zur Validierung der TAT-Cre-Transduktion und der Rekombinationsaktivitäten wurde ein zuverlässiger Schnelltest verwendet. Eine 293T-Zelllinie mit stabiler Expression eines doppelt fluoreszierenden Reporterkonstrukts wurde zur Überwachung der Cre-Rekombination (A) verwendet. Zellen exprimieren vor der Cre-Rekombination RFP. Die Cre-vermittelte Rekombination induziert die Expression von GFP durch Deletion des LoxP-flankierenden RFP-Gens. Die maximale GFP-Expression wurde erreicht, wenn 4 mM TAT-Cre zur Behandlung der Zellen über Nacht verwendet wurden. (B, C). Die Dosis-abhängigen Zunahmen der GFP-exprimierenden Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie quantifiziert (C) . Der Prozentsatz an GFP-positiven Zellen wurde gegen die verwendete TAT-Cre-Dosierung aufgetragen (D). Dabei war eine durchgehend konsistente Leistung zu beobachten.