Tumorforschung

Echtzeit-Lebendzell-Assays für 3D-Sphäroide

Ein Sphäroid-Assay erweitert die Möglichkeiten der 3D-Zellkultur-Analyse – auch in der Pharmakologie.

© Christian Zuppinger/shutterstock.com

Mehr und mehr Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Untersuchungen mit 3D-Mikrogeweben und Organoiden zu relevanteren Ergebnissen führen als solche mit 2D-Monolayer-Zellmodellen. Beobachtet wurde dies v.  a. in der Krebsforschung, in der Immunoonkologie und bei Versuchen zur Hepatotoxizität [1]. 2D-Modelle sind kostengünstig, spiegeln jedoch nicht immer die 3D-Komplexität eines In-Vivo-Tumors wider und die damit verbundenen Einflüsse der Tumor-Mikroumgebung (z. B. Zell-Zell-Kontakt oder Einfluss der extrazellulären Matrix, ECM) [2].

Sphäroid-Modelle haben einen Schichtaufbau, der aus einer äußeren Schicht schnell proliferierender Zellen, einer „Ruhezone“ und einem hypoxischen, nekrotischen Kern besteht. Dieser Aufbau resultiert aus dem Gradienten von Nährstoffen, Metaboliten und Sauerstoff – wichtige Attribute für die Bewertung einer Arzneimittelresistenz aufgrund der Durchdringung in einem heterogenen Tumor [2, 3]. Einzelne Sphäroide, die in Zellkulturplatten mit extrem geringer Bindung (ULA, ultra-low attachment) gebildet werden, eignen sich gut für Studien, in denen größere solide Tumore, u. U. mit hypoxischem Kern, untersucht werden und bei denen eine hohe Well-zu-Well-Konsistenz wichtig ist. Dieser Ansatz verhindert zudem die Beeinflussung durch komplexe und schlecht charakterisierte Biomatrizes.

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Derzeit eingesetzte Methoden zur Beurteilung von Wachstum und Schrumpfung von 3D-Tumor-Sphäroiden unterliegen einer oder mehreren Einschränkungen:

  1. Die Workflows sind zeitaufwändig, teuer und  erfordern einen hohen Arbeitsaufwand.
  2. Zellen müssen (z. B. mit einer Fluoreszenzsonde) markiert werden, was ihre Biologie beeinflussen kann.
  3. Das Auslesen einzelner Zeitpunkte stellt nicht den gesamten Zeitverlauf dar.
  4. Es kommt zu Unterbrechung der kontrollierten Umgebung, wenn Zellen zur Bildgebung aus dem Inkubator genommen werden.
  5. Indirekte Messwerte (z. B. ATP) führen dazu, dass wertvolle morphologische Erkenntnisse übersehen und/oder das Zellwachstum falsch dargestellt wird.

In einem Applikationsbericht von Sartorius Essen Bioscience werden Methode und Validierung für miniaturisierte (96/384-Well) Incucyte® S3 Single Spheroid-Assays ausführlich beschrieben. Die Assays basieren auf nichtinvasiver Hellfeld-Bildanalyse und werden mit dem Incucyte S3 Spheroid-Softwaremodul durchgeführt. Die proprietäre Bildaufnahmetechnik DF-Hellfeld (Brightfield, BF) wurde zur Erzeugung von kontrastreichen, erweiterten Tiefenschärfebildern in Verbindung mit dem Incucyte-Spheroid-Assay-Protokoll eingesetzt. Eine konsistente Segmentierung und die Analyse wurden mit einem automatisierten Bildverarbeitungsalgorithmus zur Datengenerierung durchgeführt. Dieser maskiert das größte BF-Objekt und reduziert den Bediener-Bias. So ist die Beurteilung der sphäroidischen Lebensfähigkeit ohne den Einsatz von Störreagenzien möglich.

In den flexiblen Assays wurden störungsfreie und validierte Reagenzien eingesetzt, und die automatisierte Bildgebung zur Überwachung morphologischer Veränderungen und zur direkten Messung von Tumorgröße und -zustand lieferte Ergebnisse in Echtzeit. Die auf ULA-Platten gebildeten Tumor-Sphäroide wurden zur Aufrechterhaltung der physiologischen Bedingungen inkubiert und bis zu zwei Wochen lang überwacht, um kinetische Veränderungen aufzuzeichnen.

Die Charakterisierung der Fluoreszenz wurde durch die Fluoreszenz-Bestimmung innerhalb einer Hellfeldmaskierungsgrenze erzielt. Damit entfiel die Notwendigkeit, Fluoreszenz-Maskierungsparameter wie z. B. den Schwellenwert einzustellen. Die Software-Analysetools ergaben eine unverzerrte Analyse und robuste Daten – daher geeignet für die pharmakologische Analyse. Die Einsatzmöglichkeiten in der Pharmakologie wurden zusätzlich in Form von sphäroidischen Wachstums- und Schrumpfungstests mit robuster Intra- und Interplattenreproduzierbarkeit dargestellt. Für den Proof-of-Concept für die Erforschung der Wirkmechanismen von Medikamenten wurden zelluläre Reaktionen sowohl auf zytotoxische (Camptothecin) als auch auf zytostatische (Cycloheximid) Wirkstoffe in Zellen untersucht, die stabil Incucyte CytoLight/NucLight Fluoreszenzsonden oder Zellschutzreagenzien (Incucyte Caspase 3/7 oder Annexin V) exprimieren.

Fazit

Das Incucyte Live-Cell-Analysesystem ermöglicht die Untersuchung der 3D-Einzelsphäroid-Analyse in Echtzeit und kann sowohl für wissenschaftliche Untersuchungen als auch für die nachgelagerte pharmakologische Analyse nützlich sein. Das Hellfeld ermöglicht in Kombination mit der Phasenkontrastbildgebung das markierungsfreie Studium der 3D-Sphäroidmorphologie, des Wachstums und der Schrumpfung in 96- und 384-Assay-Formaten.

Incucyte HD-Phasenbilder ermöglichen eine umfassende Visualisierung der für jeden Zelltyp charakteristischen sphäroidischen morphologischen Merkmale (Form, Größe) und interzellulären Verdichtung (lose Aggregate vs. kompakte Sphäroide). Hellfeld liefert die Mittel für die objektive sphäroidische kinetische Quantifizierung und die zellabhängige Bestimmung des Wachstumsratenprofils für verschiedene Arten von Sphäroiden. Darüber hinaus ermöglichen die kinetischen Analysen dieser Plattform in Verbindung mit Incucyte Cell Health Reagenzien oder Fluoreszenzsonden die Untersuchung der sphäroidischen Lebensfähigkeit in Echtzeit. Die Kombination aus Viabilitätsbestimmung (mit den Vorteilen der Hellfeldareal-Analyse) und morphologischen Erkenntnissen per Phasenkontrast dient als Lösung für die Sphäroid-Analyse auf einer Plattform.

Ohne vordefinierte Endpunktwahl, mit einer hochkonsistenten Hellfeldsegmentierung, reproduzierbaren, gut zu bewertenden kinetischen Daten und einer robusten Intra- und Interplattenreproduzierbarkeit ist das Incucyte auch für pharmazeutische Untersuchungen geeignet. Die benutzerfreundliche Plattform ermöglicht es dem Anwender Echtzeitinformationen zu generieren, Analysen durchzuführen und schnell und effizient publikationsreife Ergebnisse zu produzieren. Den kompletten Applikationsbericht finden Interessierte unter https://bit.ly/325xpgG.

Referenzen

[1] Elliott NT and F Yuan. A Review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Pharmaceutical Science; 100:59-74 (2011).

[2] Costa EC et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnol Adv., Dec; 34(8);1427-1441 (2016).

[3] Mehta G et al. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control Release, 164; 192–204 (2012).

Essen Bioscience
www.essenbioscience.com

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