Interferenzfreie Multiparameteruntersuchungen

Durchflusszytometrie in der Nanotoxikologie

Die Durchflusszytometrie stellt eine Alternative in der Nanotoxikologie dar, da sie interferenzfrei auf Einzelzellebene Multiparameter-Analysen ermöglicht.

Durchflusszytometrie in der Nanotoxikologie – hier wurde mit dem Modell Gallios (Beckman Coulter) gearbeitet. (Bild: UK Erlangen/Christina Janko)

Nanotoxikologische Untersuchungen werden häufig anhand von photometrischen Messungen durchgeführt. Hier liefert der Farbumschlag eines Substrates Auskunft über die Menge bzw. Vitalität von Zellen (z.B. MTT-Assay). Diese Daten geben einen Mittelwert über die gesamte Zellpopulation, die sich in einem Well befindet; Einzelzellen können allerdings nicht betrachtet werden. Da Nanopartikel häufig eine Eigenfärbung aufweisen, kann es zu Interferenzen mit dem Nachweissystem kommen. Die Durchflusszytometrie stellt eine Alternative in der Nanotoxikologie dar, da sie interferenzfrei auf Einzelzellebene Multiparameter-Analysen ermöglicht.

Die Durchflusszytometrie ist eine gängige Methode in der Zellbiologie, um mehrere Marker auf einer Zelle gleichzeitig zu untersuchen. Suspensionszellen werden mittels eines Hüllstroms fokussiert und einzeln an einem Lasersystem vorbeigeführt. Jedes Mal, wenn eine Zelle den Laser passiert, wird das Laserlicht gestreut. Das auf die Zelle auftreffende Licht wirft hinter der Zelle einen „Schatten“ („Vorwärtsstreulicht“), der einen Hinweis auf die Zellgröße gibt. Das seitwärts abgelenkte Licht („Seitwärtsstreulicht“) ist ein Maß für die zelluläre Granularität, d.h. die Menge in (intra)zellulären Strukturen und Vesikeln.

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Mit dem Streulicht lassen sich Zellen anhand ihrer Morphologie sehr gut differenzieren, dies kann man beispielsweise für die Unterscheidung von Zellen des Blutes nutzen. Gleichzeitig können zelluläre Strukturen (z.B. Oberflächenproteine) mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern angefärbt werden. Das Lasersystem des Durchflusszytometers regt gebundene Fluoreszenzmarker auf der Zelle an, die Emission der Fluoreszenzmarker wird auf verschiedenen Detektoren ermittelt. Die Anzahl der Fluoreszenzen, die gleichzeitig gemessen werden können, hängt dabei von der Laser- und Detektorausstattung des Durchflusszytometers ab. Je nach Fluss-Stärke werden pro Sekunde bis zu 1 000 Events detektiert, insgesamt werden pro Probe typischerweise 5 000 und 50 000 Einzelzellen gemessen. So können in kurzer Zeit große Mengen an quantitativen Daten aufgezeichnet werden.

Abschätzung der zellulären Nanopartikelaufnahme
Abhängig von ihrer Beschichtung, Oberflächenbeschaffenheit, Konzentration und Inkubationsdauer können Nanopartikel von Zellen aufgenommen werden bzw. an die Zelloberfläche binden. Trifft das Laserlicht auf Zellen, die Nanopartikel phagozytiert haben, wird dosisabhängig mehr Licht seitwärts abgelenkt (Bild 1). Die Menge an Seitwärtsstreulicht kann also dafür genutzt werden, die Menge an zellulären Nanopartikeln abzuschätzen. Dies ist ein relativer Wert, d. h. man kann davon ausgehen, dass die Menge an aufgenommenen Nanopartikeln mit dem steigenden Seitwärtsstreulicht korreliert; eine quantitiative Aussage, welche Menge an Nanopartikeln in der Zelle enthalten ist, ist alleine aus der Durchflusszytometrie-Messung zu diesem Zeitpunkt noch nicht möglich.

Bild 1: Zeit- und dosisabhängige Zunahme des zellulären Seitwärtsstreulichts nach Nanopartikelaufnahme in der Durchflusszytometrie. Jurkat-Zellen wurden mit Laurinsäure-ummantelten SPIONs inkubiert. A: 72 h-Zeitpunkt; morphologische Analyse der Zellen und Analyse des Mitochondrienmembranpotenzials. B: Kinetik der Nanopartikelaufnahme, gegatet wurde auf die vitalen Zellen.

Möchte man das Seitwärtsstreulicht für eine quantitative Bestimmung (Picogramm Nanopartikel pro Zelle) nutzen, muss man für jede verwendete Zellart und Zelllinie zunächst die Veränderungen des Seitwärtsstreulichts gegen die zelluläre Nanopartikelmenge korrelieren. Die Bestimmung der zellulären Nanopartikelmenge muss dabei mit einer unabhängigen Methode erfolgen. Am Beispiel von Eisenoxidnanopartikeln kann der Eisengehalt von Zelllysaten beispielsweise mittels Atomemissionsspektroskopie ermittelt werden und nach Zellzählung auf Picogramm pro Einzelzelle umgerechnet werden. Die Korrelation der Erhöhung des Seitwärtsstreulichts mit der Eisenmenge (pg) pro Zelle ergibt eine Eich- gerade, aus der aus den künftigen Durchflusszytometrie-Messungen der zelluläre Eisengehalt abgeschätzt werden kann [1]. Dies ist nicht nur für Eisenoxidnanopartikel, sondern auch für alle anderen Partikel, für die eine unabhängige Methode der Bestimmung der zellulären Partikelmenge besteht, durchführbar. Die Unterscheidung zwischen tatsächlich von der Zelle aufgenommenen Nanopartikeln und auf der Oberfläche gebundenen Nanopartikeln ist jedoch nicht möglich.

Wichtig ist es hier zu erwähnen, dass die Zelle sich durch Zelltodprozesse morphologisch stark verändert. Diese Veränderungen sind stärker als die Veränderungen, die durch Nanopartikelaufnahme hervorgerufen werden. Während der Apoptose, dem zellulären Selbstmordprozess, kommt es zur Abschnürung von Plasmamembran-Vesikeln, die die Seitwärtsstreuung des Lichts verstärken. Platzt die Plasmamembran in späten Phasen des Zelltodes auf („Nekrose“), und zerfällt die Zelle in kleinere Bruchstücke, wird das Vorwärtsstreulicht kleiner. Möchte man das Seitwärtsstreulicht für eine Konzentrationsbestimmung der aufgenommenen Nano- partikel verwenden, muss man also sicherstellen, dass die betrachteten Zellen in den verwendeten Konzentrationen noch vital sind und den Zelltodprozess nicht begonnen haben. Dies kann durch die Anfärbung mit Vitalitätsmarkern realisiert werden (Bild 1b, Gating auf Zellen mit intaktem Mitochondrienmembranpotenzial).

Bild 2: Multiparameterfärbung von HT-29 Zellen (unbehandelt, oben) und nach 48 h-Behandlung mit Mitoxantron-beladenen SPION-Nanopartikeln (2 μM Mitoxantron-Gehalt, unten).

Multiparameterfärbungen
Nanopartikel können aus diversen Materialien bestehen und in verschiedenen Formen, Größen und Beschichtungen auftreten. Häufig haben Nanopartikel eine Eigenfärbung (z.B. braune Eisenoxid-Nanopartikel), die mit gängigen toxikologischen Nachweismethoden interferiert. Werden Nanopartikel von Zellen aufgenommen oder adhärieren an die Zelloberfläche, kann eine dunkle Nano-partikel-Färbung die Absorption eines Nachweisreagenz irrtümlicherweise erhöhen.

Im Durchflusszytometer ist es möglich, Zellen und Nanopartikel aufgrund ihrer Größe und anderer Parameter eindeutig voneinander zu unterscheiden. So kann ausschließlich auf die Zellen gegatet werden, während die freien Nanopartikel aus der Analyse ausgeschlossen werden. Nanotoxikologie ist ein stufenweiser Prozess, der häufig mit der Entstehung von oxidativem Stress beginnt und schließlich in Zytotoxizität endet. Mit Multiparameterfärbungen, die unterschiedliche Parameter dieses Prozesses abdecken und der Wahl geeigneter Fluoreszenzfarbstoffe, kann ein umfassendes Bild der Nanopartikel-vermittelten Effekte generiert werden.

Für das Gallios-Durchflusszytometer (Anregungswellenlängen: 488 nm, 638 nm, 405 nm) könnte eine mögliche Farbkombination für nanotoxikologische Untersuchungen aus Monobromobimane (MBB), MitoProbeTM DiIC1(5), AnnexinA5-Fitc und Propidiumiodid bestehen. Eine Färbung mit MBB zeigt die Menge an reduziertem Glutathion an, eines der wichtigsten als Antioxidans wirkenden Stoffen im Körper. Der kationische Cyaninfarbstoff DiIC1(5) akkumuliert in Zellen mit aktivem Mitochondrienmembranpotenzial (ΔΨm), färbt also Zellen mit funktionierender Atmungskette an.

Der Verlust des elektrochemischen Gradienten ΔΨm ist ein frühes Ereignis im Zelltodprozess. Vitale Zellen haben normalerweise eine asymmetrische Plasmamembran, bei der sich Phosphatidylserin auf der Innenseite befindet. Im Verlauf des Zelltodes wird Phosphatidylserin auf der Außenseite der Zellen exponiert, das dann von dem Protein AnnexinA5-Fitc calciumabhängig gebunden werden kann. Im Gegensatz zu nekrotischen Zellen haben apoptotische Zellen noch eine intakte Plasmamembran. Mit dem Plasmamembran-impermeablen Farbstoff Propidiumiodid lassen sich nekrotische Zellen anfärben, da er die zerstörte Plasmamembran überwindet und dann in die DNA interkaliert (Tabelle 1). Die parallele Bestimmung der Zellzahl ermöglicht eine gleichzeitige Abschätzung der Zellproliferation.

Tabelle 1: Multiparameterfärbung für nanotoxikologische Untersuchungen

Verwendet man fluoreszenzmarkierte oder wirkstoffbeladene Nanopartikel für nanomedizinische Anwendungen (z. B. Mitoxantron-beladene Eisenoxid-Nanopartikel für die magnetische Wirkstoffanreicherung), kann man die jeweilige intrazelluläre Fluoreszenz als Maß für die Nanopartikelaufnahme bzw. Wirkstoffakkumulation ermitteln [2]. Bild 2 zeigt einen Ausschnitt aus einer Multiparameterfärbung von HT-29 Kolon-Karzinomzellen, die mit Mitoxantron-beladenen Eisenoxidnanopartikeln behandelt worden sind. Deutlich ist bei den mit Mitoxantron-behandelten Zellen eine Wirkstoffakkumulation sowie anhand der Zellmorphologie und AnnexinA5-Propidiumiodid-Färbung eine Zelltodinduktion zu erkennen (Bild 2).

Messung von Zellen in 3D
Für die Färbungen müssen die Zellen als Einzelzellsuspensionen vorliegen, d. h. entweder werden Suspensionszellen verwendet oder adhärente Zellen müssen vor der Analyse aus den Zellkulturgefäßen gelöst werden. Hier ist darauf zu achten, dass keine aggressiven Methoden verwendet werden, da dies Zellen schädigen und Mess-Artefakte verursachen kann. Da sich adhärente Zellen während des Zelltodprozesses häufig ablösen, macht es Sinn, die Überstände zu sammeln und zusammen mit den manuell abgelösten vitalen Zellen zu messen. Es ist nicht nur möglich, Einzelzellsuspensionen aus adhärenten Zellen zu präparieren, sondern auch aus 3D-Zellkulturen.

Besonders für nanotoxikologische Untersuchungen bieten 3D-Zellkulturen interessante Möglichkeiten, da hier die dichte extrazelluläre Matrix und feste Zell-Zellkontakte eine Penetrationsbarriere für Nanopartikel bilden können und so möglicherweise nur die äußeren Schichten des Gewebes mit den Partikeln in Kontakt kommen. Aufgrund der veränderten Diffusions- und Transport-Bedingungen kann es zu unterschiedlichen Ergebnissen im Vergleich mit der 2D-Zellkultur kommen. In Experimenten mit multizellulären HT-29 Tumorsphäroiden haben wir nachgewiesen, dass dies auch für Mitoxantron-beladene Eisenoxidnanopartikel gilt. Die Vermessung von Einzelzellen in der Durchflusszytometrie nach Auflösung der Sphäroide zeigte, dass ungebundenes Mitoxantron schneller in die Sphäroide eindringen kann, während die Infiltration von Nanopartikel-gebundenem Mitoxantron in Sphäroid länger dauerte. Dementsprechend traten auch die zellulären Effekte etwas verzögert auf [3].

Fazit
Mit der Durchflusszytometrie lassen sich schnell, preiswert und interferenzfrei nanotoxikologische Untersuchungen und Abschätzungen zur zellulären Nanopartikelmenge durchführen. Mittels Multiparameterfärbungen können verschiedene Phasen des mehrstufigen Stress- und Zelltodprozesses erfasst werden – und somit lässt sich ein umfassendes Bild der Nanopartikel-vermittelten Effekte gewinnen.

Literatur
[1] Friedrich RP et al. Flow cytometry for intracellular SPION quantification: specificity and sensitivity in comparison with spectroscopic methods, International Journal of Nanomedicine 2015,10 4185-4201.
[2] Janko C et al. Magnetic Drug Targeting Reduces the Chemotherapeutic Burden on Circulating Leukocytes Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 7341-7355.
[3] Hornung A et al. Treatment Efficiency of Free and Nanoparticle-Loaded Mitoxantrone for Magnetic Drug Targeting in Multicellular Tumor Spheroids Molecules 2015, 20, 18016-18030.

AUTOREN
Dr. Christina Janko
Prof. Dr. Christoph Alexiou
Hals-Nasen-Ohrenklinik, Kopf- und Halschirurgie, Sektion für Experimentelle Onkologie und Nanomedizin (SEON), Else Kröner-Fresenius-Stiftungsprofessur, Universitätsklinikum Erlangen

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