Molekulares Monitoring der RNA-Regulation

Biologisches Tool zum Nachverfolgen zellulärer Prozesse

Je besser zelluläre Prozesse wie die RNA-Regulierung verstanden werden, desto gezielter können Medikamente entwickelt werden. Besonders schwierig war es bisher, die Regulierung nichtkodierender RNA nachzuverfolgen, also RNA, die nicht weiter zu Proteinen umgesetzt wird. Ein Forschungsteam der Technischen Universität München (TUM) und von Helmholtz Munich hat ein minimalinvasives Reportersystem entwickelt, das ein hochsensibles Monitoring der RNA-Produktion sowohl nichtkodierender als auch kodierender RNA ermöglicht.

Für zelluläre Prozesse wird genetische Information in der Form von DNA zunächst zu RNA umgeschrieben. Diese wird noch bearbeitet, bevor sie entweder als Bauanleitung für Proteine dient oder selbst eine Funktion in der Zelle übernimmt. Wie viel und welche RNA gerade produziert wird, sagt viel über den Zustand einer Zelle aus. So produzieren Zellen bei einer Entzündung beispielsweise vermehrt RNA, die für die Proteine der Immunreaktion kodieren.

Werden Gene über RNA weiter zu Proteinen umgesetzt, können Forschende dies mit Hilfe bekannter Reportersysteme nachverfolgen. Jedoch kodiert nur ein Teil der humanen Gene für Proteine. Ein Großteil der menschlichen Gene ist nichtkodierend, darunter sind auch Gene für sogenannte long non-coding RNAs (lncRNA). Dies sind RNA mit mehr als 200 Bausteinen, die nicht als Bauanleitung für Proteine dienen, sondern als Moleküle selbst wichtige Prozesse in der Zelle steuern. Beteiligt sind sie nach ersten Erkenntnissen beispielsweise an der Regulierung der RNA-Produktion, der Organisation von Strukturen im Zellkern oder beim An- und Abschalten bestimmter Enzyme.

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Trotz ihrer Bedeutung für zelluläre Prozesse konnten lncRNAs mit bisherigen Methoden nur schwer und mit Einschränkungen untersucht werden, beispielsweise für fixierte Zellen zu einzelnen Zeitpunkten, da klassische Reportersysteme, die auf der Umsetzung zu Proteinen basieren, hierfür nicht verwendet werden können.

Monitoring nichtkodierender RNA
Ein Team um Gil Westmeyer, Professor für Neurobiological Engineering an der TUM und Direktor des Instituts für Synthetische Biomedizin bei Helmholtz Munich, präsentiert ein neu entwickeltes Reportersystem, genannt „INSPECT“, im Fachjournal „Nature Cell Biology“.

„Anders als bei bisherigen Methoden werden bei Inspect die Sequenzen für Reporterproteine in modifizierten Introns kodiert. Introns sind Abschnitte auf der unfertigen RNA, die natürlicherweise von der Zelle beim Bearbeiten herausgetrennt und abgebaut werden. Inspect stabilisiert die Introns jedoch so, dass sie nach dem Heraustrennen nicht abgebaut, sondern ins Zellzytoplasma gebracht und die Sequenzen zu Reporterproteinen umgesetzt werden“, erläutert Erstautor Dong-Jiunn Jeffery Truong. Das Signal der Reporterproteine, beispielsweise Fluoreszenz, können die Forschenden dann wie bei herkömmlichen Methoden detektieren.

Kodierende RNA
Das entwickelte molekularbiologische Tool löst somit nicht nur das Problem, wie sich die Produktion nichtkodierender RNA nachverfolgen lässt, sondern bringt auch Vorteile für die Untersuchung kodierender RNA mit sich. Bisherige Reportersysteme bergen häufig die Gefahr, die gesuchte RNA oder die Proteine zu beschädigen, da sie zum Beispiel direkt angrenzend an die zu untersuchende RNA gesetzt werden müssen, um im Prozess zu Proteinen umgesetzt zu werden. Das System Inspect modifiziert dagegen nur die Introns, nicht jedoch die fertige RNA oder die Proteine.

Das Team konnte die Funktionsweise von Inspect bereits anhand verschiedener Beispiele kodierender und nichtkodierender RNA bestätigen. So verfolgten sie damit die Produktion von RNA für Interleukin 2, einem Protein, das bei Entzündungen vermehrt produziert wird. Auch die Herstellung zweier lncRNAs konnten sie bereits mit hoher Sensitivität monitoren und Veränderungen in der Regulation während des untersuchten Zeitraums nachvollziehen.

Prof. Dr. Gil Gregor Westmeyer, Professor für Neurobiological Engineering an der TUM und Direktor des Instituts für Synthetische Biomedizin bei Helmholtz Munich. © Andreas Heddergott / TUM

„Inspect erweitert den biomedizinischen Werkzeugkasten um ein wichtiges molekularbiologisches Tool. Es lässt sich damit auf einfache Weise untersuchen, wie bestimmte nichtkodierende RNA-Moleküle an der Zellentwicklung beteiligt sind und wie möglicherweise ihre Regulierung verändert werden kann, um beispielsweise die Umwandlung in Krebszellen zu verhindern“, sagt Prof. Dr. Westmeyer. „Zusammen mit unserem zuvor entwickelten Reportersystem „EXSISERS“, das ein ähnlich minimalinvasives Prinzip für Proteine verwendet, könnte zukünftig ein gesamter Genregulationsprozess von der RNA-Prozessierung bis zur Produktion spezifischer Proteinformen in lebendigen Zellen untersucht werden.“

Publikation:
Dong-Jiunn Jeffery Truong*, Niklas Armbrust*, Julian Geilenkeuser, Eva-Maria Lederer, Tobias Heinrich Santl, Maren Beyer, Sebastian Ittermann, Emily Steinmaßl, Mariya Dyka, Gerald Raffl, Teeradon Phlairaharn, Tobias Greisle, Milica Živanić, Markus Grosch, Micha Drukker, Gil Gregor Westmeyer: Intron-encoded cistronic transcripts for minimally-invasive monitoring of coding and non-coding RNAs, Nature Cell Biology (2022), DOI: https://doi.org/10.1038/s41556-022-00998-6 (*contributed equally)

Publikation zum Reportersystem “EXSISERS”:
DJ.J. Truong, T. Phlairaharn, B. Eßwein , C. Gruber, D. Tümen, E. Baligács, N. Armbrust, F. L. Vaccaro, E.M. Lederer,, E. M. Beck, J. Geilenkeuser, S. Göppert, L. Krumwiede, C. Grätz, G. Raffl, D. Schwarz, M. Zirngibl, M. Živanić, M. Beyer, J. D. Körner, T. Santl, V. Evsyukov, T. Strauß, S. C. Schwarz, G.U. Höglinger, P. Heutink, S. Doll, M. Conrad, F. Giesert, W. Wurst and G.G. Westmeyer: Non-invasive and high-throughput interrogation of exon-specific isoform expression. Nature Cell Biology 23, 652–663 (2021). DOI: https://doi.org/10.1038/s41556-021-00678-x

Quelle: Technische Universität München (TUM)

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