Impfstoffentwicklung

Polyvalente RNA-Wirkstoffcocktails biotechnologisch herstellen

Die Curevac AG, ein biopharmazeutisches Unternehmen im Bereich der mRNA-Medikamente, hat vor Kurzem ihre Fertigungsmöglichkeiten für mRNA-Wirkstoffe in Tübingen erweitert. Benyamin Yazdan Panah, Manager Early ProcessDevelopment, beschreibt die Wirksamkeit und Nachteile aktueller Impfstoffe und die Chancen von Impfstoffen auf RNA-Basis und deren Herstellungbei Curevac.

RNActive® gibt dem Körper die Information, seinen Wirkstoff selbst zu produzieren (abstrahiert). (Bild: Curevac)

Die Vakzinierung mit Impfstoffen, die lebende, geschwächte oder inaktivierte Antigene wie Viren oder Giftstoffe (Toxine) enthalten, hat sich bereits vor mehr als zweihundert Jahren als geeignete vorbeugende Behandlung oft tödlicher Erkrankungen erwiesen. Schon 1796 zeigte Edward Jenner, dass nach einer Vorimpfung mit dem für den Menschen ungefährlicheren Kuhpockenvirus auch das oft tödliche humanpathogene Pockenvirus (Orthopoxvirus variolae) nicht mehr infektiös war. Durch ein konzertiertes Impf- und Bekämpfungsprogramm der weltweiten Gesundheitsorgane konnte 1980 die WHO die Welt für pockenfrei erklären.

Die „Spanische Grippe“, ausgelöst durch den Influenzastamm A/H1N1, die Anfang der zwanziger Jahre des letzten Jahrhunderts mehrere Dutzend Millionen Todesopfer einforderte, sowie die späteren Influenzastämme A/H2N2 Ende der 1960er Jahre (sogenannte asiatische Grippe) und A/H3N2 Ende der 1970er Jahre (sogenannte Hongkong-Grippe) mit weiteren Millionen Todesopfern weltweit, sind alarmierende Beispiele für zu bekämpfende und noch nicht ausgerottete virale Infektionen. So betrug laut einer Studie [1] mit 24 535 Patienten über 75 Jahren der Anteil influenzabedingter Todesfälle während Influenzaperioden bei nicht geimpften Personen 13,4 % und bei Geimpften 2,2 %.

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Die Immunogenität der tri- (Dreifachimpfstoff) und tetravalenten (Vierfachimpfstoff; dieser enthält zwei Influenza-A-Stämme und zwei Influenza-B-Stämme) Influenzaimpfstoffe konnte durch Vergleichsstudien [2] bei Kleinkindern im Alter von 18 bis 47 Monaten belegt werden. Dabei war der tetravalente Impfstoff im Hinblick auf den exklusiv enthaltenen B-Stamm effektiver, ohne gegen die drei anderen gemeinsamen Stämme weniger wirksam zu sein. So können multi- und polyvalente Impfstoffe die Immunitätsprognosen durch verbesserte und breitere Effektivität bei sich stark verändernden viralen Antigenen erhöhen.

Bild 1: Echtzeit-Wachstumskurven (OD600) von DH5α (A) und CopyCutter™ (B) Klonen mit verschiedenen Plasmid-DNAs. (Bild: Curevac)

Nachteile Protein- bzw. Virus-basierter Impfstoffe
Große gemeinsame Nachteile aller Protein- oder Viren-basierter prophylaktischer Impfstoffe sind technische Komplexität, Inflexibilität und zeitlicher Aufwand der Herstellung. So findet die Produktion des Influenza-Impfstoffes bevorzugt in befruchteten Hühnereiern statt, was mit großem zeitlichem und logistischem Aufwand verbunden ist. Zunächst werden monovalente Impfstoffe in getrennten Prozessen hergestellt und analysiert, bevor sie schließlich zu tri- bzw. tetravalenten Impfstoffen kombiniert werden. Damit verbunden sind ein kaum vorhersehbarer viraler Titer und unterschiedliche Qualitäten der Produktionen.

Neuere Methoden wie die Herstellung in Zellkultur verkleinern den logistischen Aufwand. Nichtsdestotrotz dauert die Herstellung und Freigabe dieser Impfstoffe bis zu sechs Monate. Daher sind die meisten „klassisch“ hergestellten Impfstoffe nicht als Pandemieprophylaxe geeignet.

RNA-Wirkstoffe
Die Gentherapie mittels „nackter“ oder in Vektoren verpackter DNA oder mit retro- bzw. lentiviralen Vektoren, die in Zielzellen ihre RNA-basierte genetische Information retrograd zu DNA umschreiben (reverse Transkription), haben in den letzten Dekaden Hoffnungen geweckt, einige Nachteile klassischer Impfstoffe beseitigen zu können. Leider birgt fremde DNA grundsätzlich das Risiko einer Integration in die DNA der behandelten Personen, die schlimmstenfalls durch somatische Mutation zu Krebs führen kann. Der transiente Träger genetischer Information, die RNA, kann ebenfalls als Impfstoff eingesetzt werden (3).

Bild 2: Unterschiedliche Fermentations- und Ko-Kultivierungsstrategien bei CopyCutter™-Klonen (B) mit verschiedenen Plasmid-DNAs. (Bild: Curevac)

Im Vergleich zu DNA-Impfstoffen geht von RNA-Wirkstoffen keine Gefahr einer genomischen Integration aus. RNA ist somit weitaus sicherer in der Anwendung und mit geeigneten Prozessen auch in pharmazeutischer Qualität mit im Vergleich zu klassischen Vakzinen überschaubarem Aufwand herstellbar.

RNA-Vakzine nutzen die Zellen des menschlichen Körpers als Fabriken der Impfstoffherstellung. GMP-Herstellstätten, wie sie die Curevac AG unterhält, können auf Basis einer flexiblen Plattformtechnologie unterschiedliche Impfstoffe gegen verschiedene Infektionskrankheiten herstellen. Damit wird die großtechnische Impfstoffherstellung sowohl im zeitlichen als auch im logistischen Aufwand signifikant reduziert. Auf neuartige Krankheitserreger oder neu aufkommende Variationen alter Krankheitserreger kann innerhalb weniger Wochen reagiert werden. Eine kombinierte oder multi- bzw. polyvalente RNA-Herstellung bietet darüber hinaus die Chance, unterschiedliche Subtypen eines Erregers oder unterschiedliche Erreger mit einer einzigen Impfdosis zu bekämpfen. Letztere kann in derselben Zeit hergestellt werden wie ein monovalentes RNA-Vakzin.

Der klassische GMP-Herstellprozess von RNA-Wirkstoffen beginnt mit der Herstellung der Template-DNA als Matrize für die RNA-Synthese. Die vier Bausteine der RNA – die natürlichen Nukleotide mit den Basen Guanin, Cytosin, Uracil und Adenin – werden dabei in einem streng kontrollierten Prozess mit Hilfe einer geeigneten RNA-Polymerase (z.B. die des Phagen T7) nach der Information der Template-DNA zu langen RNA-Ketten transkribiert. Anschließend werden Verunreinigungen durch kombiniertes DSP (downstream processing) aufgereinigt. Dazu gehören chromatographische Methoden wie „reverse-phase high pressure chromatography“, die in Kombination mit Filtrations- oder Fällungsmethoden reine, pharmazeutisch wirksame RNA-Wirkstoffe höchster Qualität generieren.

Bild 3: Qualitative Analyse mittels RNA-Agarose-Gelelektrophorese (A) und quantitative Analyse der Ausbeute der RNA-Synthese von tetra- bzw. pentavalenten RNA-Wirkstoffcocktails (B). (Bild: Curevac)

Voraussetzung für RNA-Cocktailherstellung in GMP
Die kontrollierte Herstellung eines RNA-Wirkstoffcocktails setzt einen verlässlichen, robusten und linear verlaufenden DNA-Produktionsprozess voraus. Die „Launenhaftigkeit“ lebender Produktionssysteme, wie etwa Escherichia coli, dem Wirt der modernen Bio- und Medizinwissenschaften, stellt dabei eine technische Herausforderung dar. Bild 1 zeigt exemplarisch das in Echtzeit aufgezeichnete Wachstum einer Auswahl an Klonen zweier verschiedener E. coli-Stämme nach Transformation unterschiedlicher DNA-Konstrukte. Das differenzielle Wachstumsverhalten beim gentechnisch modifizierten Stamm Coppy-Cutter™ ist dabei kleiner als beim herkömmlichen E. coli-Stamm DH5α. Die Streuung könnte unmittelbar mit DNA-Sequenzparametern zusammenhängen, wie die reproduzierbaren Gruppierungen derselben Klone von DH5α andeuten. Zukünftige bakterielle Stämme werden einen höheren Grad an Engineering aufweisen müssen. Sie werden nicht nur gentechnisch optimiert, sondern von Grund auf neu konstruiert sein. Dies ist notwendig, um die mit ihnen durchgeführten Bioprozesse effizienter und robuster zu gestalten. Bis dahin sind Plasmid-DNA-Produktionen auf charakterisierte E. coli-Stämme angewiesen.

Die Plasmide werden nach Aufschluss der Bakterien mittels z.B. Anionenaustausch- (AEX) oder hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) aufgereinigt und anschließend durch klassische Dialyse oder Dia- bzw. Ultrafiltration, aber auch Fällung aufbereitet. Das Ergebnis in Bild 2 bestätigt unsere Annahme, dass unterschiedliche DNA-Sequenzen zu unvorhersehbaren, wahrscheinlich toxischen Effekten führen können. Letztere beeinflussen nicht nur die Ausbeute, sondern auch die Integrität und Qualität einzelner DNA-Produktionen.

Durch Charakterisierung und Vorauswahl der Klone sowie spezielle Fermentationsstrategien kann die zu erwartende Streuung im Hinblick auf das Wachstumsverhalten reduziert werden, wie in Bild 2 exemplarisch dargestellt. Der damit verbundene Aufwand kann insbesondere bei komplexeren Mischungen immer noch erhebliche Ausmaße annehmen. Es ist darüber hinaus möglich, die Produktionen der DNA und der RNA zu entkoppeln. So könnten Lager von individuellen DNA-Konstrukten angelegt und bei Bedarf, z.B. für saisonale Grippeimpfstoffe, zusammengesetzt und als RNA-Cocktail hergestellt werden. Bild 3 zeigt exemplarisch die Ausbeute und Integrität solcher tetra- bzw. pentavalenter RNA-Wirkstoffe.

Bild 4: Qualitative Analyse mittels RNA-Agarose-Gelelektrophorese (A) und quantitative Analysen der Mischungsverhältnisse von tetravalenten PCR-DNA-Cocktails und RNA-Wirkstoffcocktails mittels Next Generation Sequencing-Technologie (B). (Bild: Curevac)

Als Alternative zur fermentativen DNA-Herstellung sind biosynthetische DNA-Herstellprozesse denkbar. Durch ihr schlankes Design und die damit verbundene bessere Charakterisierbarkeit kritischer Prozessparameter besitzen sie Vorteile gegenüber In-vivo-Prozessen.

Die Produktionsmachbarkeit vom vierfachen RNA-Wirkstoff, ausgehend von synthetischen DNA-Cocktails, ist in Bild 4 dargestellt. Die hierbei angewandte Strategie umfasst die DNA-Cocktail-Herstellung mittels PCR. Die hier verwendete moderne DNA-Polymerase verbindet Fidelität und Prozessivität und ermöglicht geringste Fehlerraten und Präzision. Diese Eigenschaften zeigen sich durch die lineare Amplifikation einzelner Konstrukte im tetravalenten Influenza-DNA-Cocktail (siehe Hochdurchsatz-Sequenzanalysen). Der daraus hergestellte RNA-Cocktail lässt sich ebenfalls mit Hilfe derselben Methode und anderer orthogonaler Methoden wie quantitativer Echtzeit-PCR und Sonden-basierten Methoden analysieren.

Die hier beschriebenen Prozesse zeigen einen vielversprechenden neuen Ansatz für eine polyvalente RNA-Wirkstoffproduktion auf. Die Entwicklung neuer Analysemethoden und deren Charakterisierung werden in Zukunft enorm zum Verständnis und besseren Kontrolle der gezeigten Herstellprozesse beitragen. Nicht zuletzt dadurch wird die Wirkstoffsicherheit zunehmen. Effektivere Wirkstoffformulierungen komplexerer Cocktails werden neue Heilungs- bzw. Behandlungsmöglichkeiten ermöglichen. Dabei rücken sowohl polyvalente prophylaktische als auch therapeutische Vakzine, günstigere Kombinationsimpfungen und multiple molekulare Therapien komplexer Krankheiten in greifbare Nähe.

Literatur
Armstrong, Ben G et al. “Effect of Influenza Vaccination on Excess Deaths Occurring during Periods of High Circulation of Influenza: Cohort Study in Elderly People.” BMJ : British Medical Journal 329.7467 (2004): 660. PMC. Web. 25 Sept. 2017.
Weber, Rodriguez MA et al. “Immunogenicity and safety of inactivated quadrivalent and trivalent influenza vaccines in children 18-47 months of age.” Pediatr Infect Dis J. 2014 Dec;33(12):1262-9.
Hoerr, Ingmar et al. “In vivo application of RNA leads to induction of specific cytotoxic T lymphocytes and antibodies.” Eur J Immunol. 2000 Jan;30(1):1-7.

Autor:
Dr. Benyamin Yazdan Panah
Curevac AG

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